传染病突发事件处置实验室检测

传染病突发事件处置,实验室检测 商洛市CDC 魏惠芳 2014.10.,主要内容,一、实验室在传染病突发事件应对中的作用 二、实验室在传染病疫情中的任务 三、突发公共卫生事件现场调查与实验室之 间的关系 四、突发公共卫生事件检验原则,一、实验室在传染病突发事件中的作用,实验室在传染病疫情控制中具有重要作用。无论是基础研究还是应用研究都离不开实验室的工作，这些工作主要包括病原学检测与诊断、预防与控制（包括疫苗）、药品研究等方面。病原学研究包括病原的鉴定、病原体分子生物学、病原体可能的来源、病原体致病机理等。,实验室在传染病突发事件中的作用,传染病的诊断需要综合实验室检验结果。传染病的诊断应包括流行病学资料、临床病史、体格检查以及实验室检验结果等。病原体的检出是确诊传染病的主要依据。应尽一切可能分离到病原体，特别是细菌、真菌等。病毒感染因病原不易被检出，培养需较长时间，一般实验室难以开展病毒分离工作，因此在大多数情况下依赖免疫学试验而确立诊断。此外，还有分子生物学检测、影像检查、活体组织检查等。,实验室在传染病突发事件中的作用,总之，实验室在确认疫情性质、追踪传染病的来源、摸清潜在的传染源、为感染者寻找有效的治疗措施等方面发挥着重要的作用。,二、实验室在处理传染病突发公共卫生事件中的任务,重点介绍：现场病原微生物标本的采集 病原微生物标本的保存、包装、运送病原学检测血清学检测免疫学检测核酸检测现场快速检测其他检测方法,1、现场病原微生物标本的采集,采样时生物安全的考虑采样时间采样容器采样标本的标识各种标本的采样方法,采样时生物安全的考虑,采样中避免污染对于人员和标本都是至关重要的，应采用防护措施，注意安全操作。 基本的安全要求如下：采样戴手套；采样中尽可能穿防护服；消毒人员要穿戴防护服和厚橡胶手套；污染的材料应先消毒后清洗或先消毒后废弃；使用口罩、护目镜、呼吸面罩，用于防止有高度传染力的可吸入病原；特殊情况下可搭建简易焚烧炉，焚烧后将废弃物深埋。,采样时间-1,一般在怀疑细菌感染时应尽量在急性发病期和使用抗生素之前采集标本，进行细菌的分离培养，否则这种标本在分离培养时要加药物拮抗剂。例如使用青霉素的要加青霉素酶，磺胺药的加对氨苯甲酸。根据不同疾病的特点和临床表现，需要采集的标本种类、检测目的、采样时间及采样要求也不尽一致。,采样时间-2,例如伤寒病人应在发病早期未使用抗生素之前采血培养，在23周时停用抗生素2天后采粪便培养。作病毒分离和病毒抗原检测的标本，应在发病初期和急性期采样，因为此时病毒在体内大量繁殖，检出率高，病毒分类标本最好在发病12天内采取。,采样容器,采集标本应使用无菌容器，一个标本一个容器。对容器基本要求是选耐用材料制成，容器包装好后可防渗漏。能承受空中地面运送过程中可能发生的温度和压力变化。,采样标本的标识-1,标本标签内容应齐全。包括种类、原始采样容器、标本性质、数量、运送人和接受人及其包装日期、运输日期、统一的识别编号及病人联系方式、姓名、检验目的、临床诊断等信息。在暴发调查中个案调查的信息应和标本同时收集，并且能够互相符合。每个患者应用惟一的统一编号，它是实验室结果和标本及患者之间的联系，能够准确影响到进一步的调查及对疫情的控制措施。,采样标本的标识-2,其他信息如病人信息（年龄、性别、完整地址），临床资料（发病日期、临床症状、治疗史、可疑的发病原因、采样前是否用抗生素），急性或恢复期标本，症状类似病人的其他标本。接收标本的实验室也应记录接收日期和时间、接受标本者的姓名、标本性质和状态等。这些信息都是解释检验结果所必需的。,各种标本的采样方法-1,尸体标本采集有病理变化的脏器或组织；如：肺、肝穿刺。(病原学研究死后6h ，病例检查24h。同种组织每一部位至少采集3份标本。)临床标本根据临床特征、检测目的，采集不同的标本。注意无菌操作，尽量避免污染。采取局部病变标本处，以无菌生理盐水冲洗，拭干后再取样。尽可能采集病变明显部位的材料，如结核病人的干酪样痰液等。,各种标本的采样方法-2,临床标本的采集可以分为以下两类。 一类是用于细菌或病毒分离或检测抗原用的标本。如：粪便、咽拭子、痰液、尿液、血液、脑脊液等；另一类标本是用于病原抗体检测的标本。通常包括血液和脑脊液。,用于检测抗原的标本采集方法-1/3,粪便标本的采集应在急性腹泻期及用药前采集自然排出的粪便，挑取粘液或脓血部分。液状13mL；成形约5g。咽拭子、含漱液或痰液的采集令患者仰头张口，用压舌板压舌，将无菌棉拭子伸入口腔涂抹双侧咽扁桃体及咽后壁数次后，放入2mlHanks液试管中。含漱液使用生理盐水（0.9%），先让病人咳嗽，然后以含漱液反复冲洗咽部1分钟，漱毕直接吐入试管内。肺部感染以清晨第一口痰为最佳。脑脊液在无菌条件下由腰椎穿刺，用无菌试管收集35ml，（作厌氧培养时标本应注入厌氧瓶内），操作最好在医院内由有经验的医生按腰椎穿刺术进行。,咽拭子：,咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（适度用力，避免触及舌部），将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。即擦拭 扁桃腺及咽后壁,鼻拭子：,鼻拭子： 分两次，每次用1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入一侧鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。两次拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。,用于检测抗原的标本采集方法-2/3,血液样本的采集作血液病原培养时，严格用无菌穿刺法采静脉血，移入无菌的有螺口的抗凝的容器或培养瓶中送检。 尿液采集关键是无菌操作并在用药前采集。主要是中段尿采集法，先用肥皂水清洗外阴部，再以无菌水洗净，一般取首次晨尿的中段尿1020ml于无菌试管内。 皮肤样品采集大多数皮肤病的诊断主要依据体格检查和临床病史 ，不需要采集标本。在诊断不明确、表现异常等少数情况下，可能需要采集皮疹或皮肤病变标本。,用于检测抗原的标本采集方法-3/3,尸体标本的采集取尸体标本时每个标本用单独的无菌活检针至少取12g感染部位标本，放入单独的装有相应培养基的无菌容器中。 用于核酸检测的标本采集要求符合规范。如采集咽拭子或肛拭子等用于检测核酸时不能使用棉拭子和木质拭子棒，因为这类材料中含有核酸扩增抑制剂，而要使用灭菌人造纤维拭子和塑料棒。,用于抗体检测的标本采集方法,血清用于检测IgM的血清一般采于发病1个月内；用于检测IgG的血液应收集两次，第一次于发病初期（13天），越早越好，第二次血样一般在恢复期（第一次采血后34周）。双份血清同时检测，如抗体滴度有4倍以上升高才有意义。 脑脊液一般于出现神经症状时采集，查IgM只需一份脑脊液，而查IgG则需收集两次，时间间隔同前所述。,2、病原微生物标本的保存、包装、运送,病原微生物标本的保存-1应选择合适的培养基和推荐保存温度。这取决于运送时间的长短及不同病原微生物对干燥、温度、营养、pH值的耐受能力。用于分离培养细菌的标本应在运送培养基中运送并保存于合适的温度（如脑膜炎奈瑟菌离体后迅速自溶，容易死亡。）能确保目标细菌的存活并抑制其他微生物的过度生长。,病原微生物标本的保存-2,用于分离病毒的标本，一般应放在保温容器（0C4C）里，不可放置超过48小时，如不能立即分离病毒时，应将标本冻存保存。若长期储存，最好在70C冻存。 如怀疑是寄生虫，所取粪便中加入10%福尔马林和PVA防腐剂（充分混合）存于4，新鲜粪便存于-15。,病原微生物标本的保存-3,用于检测抗原或抗体的标本可在4C8C保存2428h，在20C保存时间更长。检测抗体的血清可在4C保存约一周，超过一周必须在-20C下冷冻。一定要注意避免不必要的反复冻融。 保证样品运送所需温度的方法为维持4C8C，运送盒中要填充冰袋。为保证-20C条件，在外包装袋内装干冰，但需确保二氧化碳能释放以防爆炸。为保证70C条件，可采用液氮用来储存和运送。,病原微生物标本的包装-1,任何感染性材料的包装和运输都必须遵循WHO对传染性物质和诊断性标本的安全运送指南（WHO，1997）。标准的包装方法和材料应能确保即使在运送中包装意外受损时也能保护人员的安全及标本的完整。因此运送标本时要进行三层包装。,病原微生物标本的包装-2,原始的容器应该是防漏的，可盛容量不大于500ml。在原始容器与第二层包装之间应放置有吸附作用的材料。并辅以第二层防漏包装。运输标本的外包装必须有明确的标签，标明寄送人和接收人的详细联系方式、包装日期和运输日期等。,A类感染性物质的包装与标签,B类感染性物质的包装与标签,病原微生物标本的运送-1,地面运送标本时注意将装有标本的箱子紧紧固定在交通工具上，车上还应备有吸水材料、消毒剂、手套、口罩、护目镜、密封防水的废弃物容器等防护用品。为避免路途颠簸引起标本溶血，可在运送前分离血清。 在国际、国家、商业的有关规定允许下，诊断标本也可空运，应注意规范包装。,病原微生物标本的运送-2,分离培养细菌、病毒的标本大多数要求冷藏运送。 除不耐寒的脑膜炎球菌等应在35C37C保温运送外。血液标本用于细菌、病毒或寄生虫分离时，需低温保存，不能冷冻。用冰块而不是干冰运送。做立克次体类微生物的全血标本要求干冰保存和冷冻运送。检测核酸样品的运送要求低温快速。 从标本采集到检测的间隔时间要尽可能短，并尽可能将标本处于冷藏状态。检测前保存时间较长时则需冷冻标本防止核酸降解。,3、病原学检测,直接涂片镜检形态学观察细菌的分离培养细菌的鉴定病毒的分离培养,直接涂片镜检形态学观察,直接涂片染色后镜检适用于形态和染色上具有特征性的病原菌。例如痰中查见抗酸性细长杆菌，脓液中发现革兰氏阳性葡萄串状球菌，咽喉假膜中有异染颗粒的棒状杆菌及霍乱弧菌、艰难梭菌等。优点是方便快捷，缺点是适用范围小。,细菌的分离培养,无菌部位采集的脑脊液、血液等标本，可直接接种至营养丰富的液体或固体培养基。有正常菌群存在部位所取标本（如粪便），应接种至选择或鉴别性培养基。缺点：耗时较长（需4872h），过程繁琐，优点：能获得病原菌，特异性为100%，是许多细菌性传染病实验室确诊的最重要证据，因此，在暴发疫情中要求尽可能进行病原菌分离来获得实验室确诊证据。,细菌的鉴定,生化鉴定生化代谢特征是鉴定病原菌的重要方法之一。如糖发酵试验等。现有多种微量、快速、半自动或全自动细菌生化反应试剂盒和检测仪器，极大地方便了菌株鉴定工作。血清鉴定与分型利用已知的特异抗体的诊断血清可以确定细菌的种和型。常用方法是玻片凝集实验，在数分钟内能可得出结果。,病毒的分离培养,病毒只能在活细胞中增殖，分离病毒常用的是动物、鸡胚和各种细胞。动物接种：实验动物要有易感性、必须健康，而且大小、性别和品系相同。鸡胚培养：如分离流感病毒、腮腺炎、疱疹和痘类病毒。细胞培养常用的细胞来源有两种，一是原代细胞培养，即将动物的器官或组织用胰酶消化成单个细胞，再加入培养液在体外培养。另一种是传代细胞培养，这种细胞是来源于原代细胞，但是已经适应在体外的培养环境，能够连续的在体外传代培养。,4、血清学检测,适用范围主要适用于抗原性较强的病原菌和病程较长的传染病的诊断。用已知细菌或抗原检测病人体液中有无相应抗体及抗体效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。结果判定诊断意义,结果判定,由于隐性感染和近期预防接种也会产生相应抗体，因此只有当抗体效价明显高于正常人群的水平或随病程递增才有诊断价值。多数血清学诊断实验需取患者急性期和恢复期双份血清标本，当恢复期抗体效价比急性期升高4倍或4倍以上时才有意义。如果病人在疾病早期使用抗菌药物，病原菌在体内繁殖不多，抗体增长可以不明显。,诊断意义,病原学检查和血清学诊断是相互辅助的。在不能分离到病原时，更具有重要意义。例如：直接凝集实验可辅助诊断伤寒、副伤寒（肥达实验）；双向扩散凝集实验可诊断白喉毒素（Elerk实验）；对流免疫电泳可诊断流行性脑膜炎。,5、免疫学检测,免疫学检测是感染病原检测的首选办法，简便快速，准确率也较高。凝集反应包括直接凝集反应、间接凝集反应、间接凝集抑制反应和协同凝集反应。沉淀反应免疫标记技术,沉淀反应和免疫标记技术,沉淀反应主要有单免疫扩散、双免疫扩散和对流免疫电泳。免疫标记技术包括免疫荧光技术、放射免疫测定和免疫酶技术，其中免疫酶技术还包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、夹心法，以及生物素加亲和素的ELISA方法。现场应用最多的是ELISA方法。,6、核酸检测-1,核酸诊断主要用于检测难以培养的微生物、或目前培养方法不敏感、花费高或耗时太久的情况。优点：省时，灵敏性高。在严格控制实验过程的条件下，对于病因诊断有很好的作用。缺点：实验过程控制不严格时可能产生假阳性结果。实验条件、经验和试剂成本要求高。因此在应用时要考虑对疫情控制的需要，考虑必要性和可行性。,6、核酸检测-2,核酸检测方法主要有如下几种：聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）分子杂交技术（molecular hybridization）基因芯片技术序列分析,聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）,具有特异、敏感、快速、简便和容易自动化等特点。为增加灵敏度和特异度，普通PCR又演化有多种方法，如RT- PCR、PCR-RFLP、套式PCR、多重PCR、实时PCR技术。近来实时PCR技术用于临床检测得到迅速发展和普及，可实时检测到信号的变化，并且整个反应过程为密闭，不需电泳检测结果，避免了产物的扩散和交叉污染，具有较好应用前景。,分子杂交技术（molecular hybridization）,通常在支持膜上进行，又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交和RNA印迹杂交。DNA探针杂交在检测没有成熟可靠的培养方法的临床标本时具有突出的优点，如HPV、乙肝病毒（HBV）、和EB病毒的检测。与传统鉴定方法相比，针对荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌和新生隐球菌的检测探针具有独特的优点。,基因芯片技术核酸检测,芯片是一块方形的玻璃，上面铺了一层肉眼看不见的DNA探针。待测的样品基因被切成长短不一的片断，用荧光化学物质标记，然后作为一种溶液注射到嵌有芯片的胶片上。用装有激光设备的仪器来检测，通过激光光束激发后会发出荧光。荧光的强弱与DNA探针杂交程度有关，根据荧光强弱的图案就可以检测目的基因。用于现场诊断也有一定应用前景。,序列分析,测定核酸一级结构的方法，是目前鉴定细菌或病毒特征的有效方法。对已知的病原体，通过特定序列测定可以精确地鉴定出所属的亚型；对未知的病原体，通过序列测定可以确定其在生物分类学上的归属。1999年我国在青海省检出的输入性脊髓灰质炎野病毒以及SARS病毒属于冠状病毒的确定都是通过序列分析得到的结果。,7、现场快速检测,快速检测方法操作过程简单，结果判断不需借助仪器或只需要小型的仪器。适合现场应用，要求灵敏度高、对特异度的要求相对低些，以便能进行初筛。胶体金层析检测卡优点是方便快速，标本处理简单、无需仪器、肉眼判定结果、并且一般在15min内完成，适于现场使用。但结果的可靠性需要证实。 此外，还有ELISA法、直接涂片法等。,8、其他检测方法,抗生素敏感性检测对分离的病原菌进行抗生素敏感性试验能够知道临床用药和制定暴发疫情中高危人群的预防服药控制措施；还能观察病原菌的耐药谱变迁，了解局部地区细菌耐药的危害程度；对细菌性传染病的有效控制和减少抗生素滥用具有重要意义。细胞毒素检测动物实验,细胞毒素检测,许多致病菌可产生外毒素，这些毒素可能具有神经毒性、肠毒性、细胞毒性，检测这些细菌毒素有助于细菌鉴定及毒力鉴定，如检测白喉毒素、霍乱毒素、志贺毒素、金葡菌毒素等。现有已研制出几种检测常见细菌毒素的仪器，能够快速进行检测。,动物实验,主要用于分离鉴定病原菌、测定菌株产毒性等。例如常用家兔或豚鼠皮肤检测白喉杆菌能否产生白喉毒素；用豚鼠眼结膜角膜检测志贺菌的侵袭力；用家兔肠断结扎试验检测细菌肠毒素。,三 、突发公共卫生事件现场调查与