代谢工程与合成生物学作业-生物元件

合成生物学的生物部件622(山东大学生命科学学院，济南，250100 )摘要：合成生物学强调“设计”和“再设计”，其目的是通过人工设计和构建自然界中不存在的生物系统来解决能源、材料、健康和环境保护等问题，其工程化思想和标准化工具的兴起引起全世界的关注。 生物系统的分层结构是合成生物学本质化的典型表现，合成生物系统中最简单的基本生物模块被称为生物部件(part )，它是自下而上研究策略的基础部分，本文回顾合成生物学中常用的生物部件级标准化使用方法，对启动子和核发开关进行研究关键词：合成生物学、生物部件、生物部件1953年，年轻的J.D.Watson和F. Crick从DNA的x射线衍射图解读双螺旋结构，隐藏了数十亿年的生物代码。 2003年人类基因组计划顺利完成后，包括人类在内的各种生物的图像陆续被制作，生物遗传编码的神秘面纱迅速揭开。 生物学从定性描述转向定量计算，从分析进入设计、系统和合成生物学(synthetic biology )时代。目前，合成生物学的定义还处于多个阶段，比较全面地说，合成生物学就是根据一定的规律和现有的知识，设计和建设新的生物部件、装置和系统，重新设计现有的天然系统，为人类的特殊目的服务。 由此定义，合成生物学包括自下而上的研究策略和自上而下的研究策略，前者的探索具有艰难而划时代的意义。 合成生物学最终借鉴电子学的方法，希望能像“积木”一样构建基因电路，这是最基本的模块化部件。我们将标准的接口、功能相对独立的生物高分子、信号传递路径、基因电路等称为“模块”或生物块，模块的规模可以小，分为部件、装置、系统、多细胞系统等几个层次，其中最基本的是生物部件。 模块设计体现了合成生物学的精髓，模块常常具有信息隐蔽、凝聚结合、封闭性开放性的特性。 常见的生物部件根据功能分为启动子、核开关、RBS、终结子、操纵子、蛋白编码基因(CDS )、报告基因、标签单元、操纵子等，当然这些分类层方面并不绝对。1 .启动子1.1启动子的结构启动子是与RNA聚合酶的特异识别相结合的DNA序列，在原核生物和真核生物中存在差异。1.1.1原核生物中的启动子原核生物中的启动子通常通过RNA聚合酶或因子来标识DNA上的特定序列，而70是相对常见的因子，通常特异地标识启动子的-10和-35两个保守的DNA盒(图1 )。图1原核生物中的启动子示意图1.1.2真核生物中的启动子结构与原核生物启动子相比，真核生物启动子更为复杂，RNA聚合酶核启动子是转录过程中重要但容易被忽视的因素。 核启动子定义为DNA扩张，复盖RNA的起始部位，典型的核启动子长约40至50核苷酸，指导基因转录的开始。 传统上估计核心启动子在功能上是公共的，并且转印开始是通过共享该公共机制而进行的。 最近的研究表明，各种核心启动子的结构和功能有很大差异。 许多DNA元件作用于核启动子的活性，而给定核启动子的特定性能取决于这些核启动子修饰因子的存在或不存在。 已知的核启动子元件包括TATA外壳、Inr (启动子)、BREuATA外壳上游的BRETFIB(RNAii聚合酶的转录因子)标识符和BREd(TATA外壳下游的bre )、MTE (十基序列器件)、DCE (下游核器件)和dpe (dpe )图2真核生物中启动子的示意图1.2启动子的种类在合成生物学和以前的生物学研究中，我们已经标准化了许多启动子要素(表1 )。 最典型的启动子是乳糖操纵子中的乳糖启动子，是由乳糖诱导的，在实验中我们常常由IPTG诱导的色氨酸启动子所关注的特性， tac启动子是上述两种启动子的融合启动子，典型的强启动子Pl、Pr是噬菌体溶解源和分解生长状态转化和维持中的重要启动子抑制蛋白质的温度敏感性突变是常用的能诱导温度的PtetA基因启动子之一，脱水四环素诱导的T7启动子是一种比较特殊的启动子，RNA聚合酶的种类有特异性。表1一般启动子概述启动子名称英文字母调节基因衍生物备注乳糖启动子PlacZlacI异丙基硫代半乳糖苷(IPTG )可以诱导负反馈色氨酸启动子PtrptrpR- trp能够阻止负反馈(！ 弱化子)tac启动子PtaclacIqIPTG、乳糖和温度敏感性整合启动子启动子Pl、PrPl/PrcIts857温度敏感可以诱导负反馈四环素溢出泵基因启动子PtetAtetR蛋白家族四环素(Tc )脱水四环素(aTc )可以诱导负反馈T7启动子Pt7大肠杆菌的RNA聚合酶无法识别，但噬菌体和真核生物的RNA聚合酶是可能的1.3启动子的控制及意义为了实现某些目的，微生物系统工程学需要一些设计工具，这些工具以某种可预测的、定量的方式工作。 在合成生物学领域，基因之间的级联调控多发生在转录水平(图3 )，但由于它们在转录开始阶段起作用，即与启动子有关，因此将启动子标准化对整个系统的运行具有重要意义。图3转录水平调控基因表达的设计工具在由下而上的研究策略中，我们经常使用基因电路来模拟电子学的逻辑开关，从简单的逻辑或否定到双稳态开关，以及基本上所述的启动子及其控制基因按照一定顺序排列。另外，在合成生物学学术比赛iGEM中，相当多的团队作品的关键是感受到一些具有特殊功能的启动子及其相关组件，如感光、温敏、重金属离子。图4双稳开关(左)和振子(右)的逻辑结构2 .核糖开关1991年，E.coli的btuB基因转录产物5UTR中存在保守序列，adoc bl和B12可以表达btnB基因，但未发现能与adoc bl结合的蛋白因子，1990年，Andrew很快从合成的RNA序列中发现， 筛选与有机染料配体特异性结合的RNA，命名为“aptamer”，2002年，Breaker受到适体的启发，证明了该天然适体的存在，并命名为“核糖开关”。 截至目前(2009年)已发现12个以上的核糖开关(如表2表1所示)，因此大部分是抑制性的(相应的代谢物存在时基因关闭)。 主要参与氨基酸、核苷酸、维生素等基础物质的代谢。表2一些已知的Riboswithch的名称、调节小分子和功能在RNA开关中，mRNA本身作为传感器，直接感受环境中对应代谢物的变化，与代谢物结合后发生构象变化，在转录和翻译水平上调节基因的表达。 RNA开关也是反馈调节机制，与以往发现的调节机制不同之处在于，不需要介导蛋白质(乳糖操纵子)和核糖体(色氨酸弱体)，RNA直接感受环境中代谢物的变化，形成选择性的茎环结构，从而在转录延伸和翻译开始水平上表达基因2.1释放开关的作用机理所发现的细菌RNA开关位于代谢相关基因mRNA的5UTR，由两个区域组成：个区域(aptamer domain，AD )和表达区域(expression domain，EPD )。 AD直接与小分子代谢物结合，是一种RNA传感器。 序列分析表明，在不同细菌的同类RNA开关中，AD序列保持保守，形成高度相似的次级结构。 与配体结合后，AD的构象发生变化，信息传入EPD，后者通过形成选择性茎环结构直接调节基因的表达。 不同核糖开关的EPD可能利用不同的机制调节基因表达。 (图5 )目前发现的真核生物核糖开关位于3utr或内含子中，具有类似的AD和EPD，可能在多个环节调节真核生物基因的表达。图5释放开关的作用机构为了研究RNA开关的作用机制，F.J.Isaacs等构建了人工Riboswithch (图6 )，其转录后控制比转录水平控制更快。 当基因正常表达时，启动子p调控gfp的表达。 通过转录形成的mRNA的RBS露出到外部，一旦核糖体识别并结合，mRNA就被翻译成蛋白质。 另一方面，人工构建的Riboswithch在启动子Pcr和RBS之间插入与RBS互补的cr序列。 转录后mrna 5与RBS结合形成卡发行结构，隐蔽RBS与核糖体的结合并组织翻译进程。 启动另一个启动子Pta后，就会发现短链无序RNAtaRNA。 taRNA以高特异性优先定位于crRNA，通过线性环相互作用可以解开CRNA的发夹环，taRNA的尾部和crRNA互补成对。 此时，crRNA的RBS部位外露，核糖体可与其结合重新激活翻译。2.2核糖开关的应用2.2.1小分子抗菌药物riboswitch广泛分布于人类细菌性病原体内(如riboswitch作为药物靶点，具有广泛的应用前景。临床常用抗菌药物的毒性机制已经证实以riboswitch为药物靶点。 例如吡啶胺(pyrithiamine，PT )是常用的硫酸铵代谢对抗物，是维生素B1 (Thiamine，硫胺)的类似物。 细胞内易磷酸化为吡啶磺酸焦磷酸盐PTPP。 PTPP可以与许多TPP riboswitch结合(其亲和性与TPP相似)，抑制TPP riboswitch调控的基因表达。图6用于调控转录后基因调控的人工Riboswithch系统表3人类细菌性病原体，包括若干Riboswithch控件2.2.2细菌趋向运动细菌趋势运动的研究在生物降解、生物纳米、合成生物学等领域具有重要意义。 Shana Topp等人在大肠杆菌中设计了用小分子和mRNA指导细菌运动的系统。在野生型大肠杆菌中，蛋白CheY受到鞭毛马达旋转方向的控制，CheY未被磷酸化时，鞭毛马达逆时针旋转，CheY-P与鞭毛马达蛋白FliM结合，细胞滚动，因此野生型大肠杆菌能够在半固体琼脂上移动。 但是，当CheZ蛋白质缺失时，CheY-P不能去除磷酸化，细胞只能滚动而不能移动。 (图7 )研究人员在CheZ蛋白编码基因前设计核糖开关(图8左)，首次与茶碱结合改变配置，与核糖体结合翻译CheZ进行细胞运动。 因此，改造后的大肠杆菌只能在茶碱存在的地区移动(图8右)。图7大肠杆菌CheY及其与运动的关系图8 Riboswithch设计(左)和实验结果(右)3 .生物零件的探讨生物部件是最简单最基本的生物块，能够以标准化的组装方法与其他部件组装更复杂的模块。 目前，生物部件的数量和质量还没有达到合成生物学的预期要求。 零件的开发有几个问题。需要为每个部件赋予适当的名称这样庞大的部件库，通过严格地统一规范来实现是不容易的。生物部件之间的连接也是一个大问题，通常是通过设计复杂的酶切部位来实现的，但随着一些新的组装手段的出现，这就变得容易了。较难解决的问题是标准的定量机制，有PoPS(RNA polymerase per second )、rips (ribosonmalinitiationspersecon )等概念，这是具有量化作用的抽象概念，合成生物基因元件的量化是模块自身的过程参考文献1.molecularbiogyofthegenesixthedition2 .合成生物学指导论宋凯编着3.perspectivesonthernapolymeraseicorepromoterbiochemicsociety，2006，34 (pt6 ) :1047-10504. Seo S W，Yang J，Min B E，et al.synheticbiogy : toolstodesingmicrosobefortheproductionofchemicalsandfuels j .biotechnologiesadvance5 .赵文超，雪永常，王雪霞.核糖开关基因表达调控元件J .生命化学，2009 (1): 56-596 .赵谨、杨克恭、张学.新发现的基因表达调控机制核糖开关J .中国