生物技术在林木育种中的

,第11章生物技术在林木育种中的应用,主要内容,组织培养体细胞胚胎发生和人工种子遗传标记技术在林木遗传育种中的应用基因工程在林木育种中的应用,一、遗传标记技术在林木遗传育种中的应用,（一）、遗传标记的概念遗传标记（geneticmarker）是指可以稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异或者是DNA序列的差异。,遗传标记主要有形态标记（morphologicalmarkers)、细胞学标记（cytologicalmarkers)、同工酶标记(isozymemarkers）和分子标记(molecularmarkers)。,理想的分子标记：多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息；在基因组中大量存在且分布均匀；选择中性，即无基因多效性，不影响目标性状的表达；检测手段简单、快速，容易观测记载，成本低；实验重复性好。,1形态标记形态标记即植物的外部特征和特性。,广义的形态标记还包括借助简单测试即可识别的某些形状如生理特性、生殖特性、抗病虫性等。,形态标记的特点是简单直观，通过细心观察从表型上就可将不同个体区分开来，长期以来用于林木遗传种质资源鉴定及品种选育。,形态鉴定需额外占用土地，标记位点数少，周期长，花费大，易受环境、发育阶段、生理因素和人为因素的影响，准确性差，容易出现漏选、错选，而且需要有丰富的实践经验和知识，一般用于对大量材料进行初步筛选。,2细胞学标记细胞学标记能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。,带型特征是指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，由此可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。,染色体结构特征包括染色体的核型和带型。核型特征是指染色体的长度、形态、着丝粒的位置和随体有无等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异。,染色体数量特征是指细胞中染色体数目的多少。染色体数量上的遗传多态性包括整倍性和非整倍性的变异，前者如多倍体，后者如缺体、单体、三体、双体等非整倍体。,细胞学鉴定工作量较大，并不能很好地消除环境对性状的影响，而且基因的显隐性、上位性及连锁等会影响分析结果，再加上标记数目有限，对于染色体数目较多或染色体较小的植物难以进行理想的鉴定分析。,3生化标记生化标记是以基因表达的直接产物蛋白质为特征的遗传标记，它包括贮藏蛋白标记和同工酶标记。,生化标记具有结果稳定可靠，不受环境因素影响，呈共显性，在分离世代中能反映各单株的基因型，检测相对简单快速，在种子和幼苗期就可以鉴定，且所需材料少，费用不高等优点。,在植物的群体研究中，仅有10-20种同工酶表现出位点的多态性。因而同工酶标记也有其局限性，不能成为最理想的遗传标记。,同工酶（isozyme）指来源相同，催化同一化学反应，而蛋白质分子结构、组成又不相同的一类酶。,AAT、ACP、ACO,4.DNA分子标记,DNA的分子标记是以DNA分子多态性为基础的遗传标记。,分子标记的优越性：直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高；表现为“中性”；有许多分子标记表现为共显性。,红色箭头所指的为特异带,ISSR分子标记鉴别落叶松种,DNA分子标记检测技术可分为3类：第一类是以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术，其代表性技术有限制性片段长度多态性（RFLP)；,第三类是以DNA序列为核心的分子标记技术，其代表性技术为表达序列标记（EST）和单核昔酸多态性（SNP)。,第二类是以DNA聚合链式反应（PCR）技术为核心的分子标记技术，其代表性技术有随机扩增多态性DNA(RAPD）标记、扩增片段长度多态性(AFLP）和简单重复序列（SSR)等；,（三）、分子标记在林木遗传育种中的应用1分子遗传图谱的构建遗传图谱（geneticmap)，又称连锁图谱（linkagemap)，是指遗传标记在染色体上的相对位置，或称“遗传距离”。,遗传图谱的构建过程主要包括：选择和建立适合的作图群体；确立遗传连锁群；基因排序和遗传距离的确定。,（1）亲本的选择DNA序列差异是作图的分子基础，应该选择亲缘关系远而多态性大的品种或物种材料作为分离群体的亲本，然而亲本间差异过大，杂种染色体之间的配对和重组会受到抑制，非整倍体的机率增大，导致连锁位点间的重组率偏低，影响图谱的可靠性和适用范围，同时会降低结实率，甚至杂交后代不育。,F2代群体由于F2可提供祖代连锁的其他信息，祖代标记对于树木复杂的遗传学解释具有重要价值。已见构建F2群体的树种有：毛果杨（Populustrichocarpa)美洲黑杨（P.deltoides);辐射松（Pinusradiata)；火炬松（Pinustaeda）等。,F2代群体适用于杂合度低的树种。其特点是：群体具有永久性质，利于引物及探针筛选及数量性状的系统研究，同时利用共分离分析及分离个体混合分析进行基因定位。不足之处是，建群时间长，有些树种可能发生近交不亲和或近交衰退现象。同时非整倍体出现机率增加。,（2）作图群体的建立,F2群体、回交群体、F1代群体、单倍体群体,回交群体由F1代再与其亲本之一进行杂交产生。回交一代类似F2代群体。已构建回交群体的树种有：中国栗（Castaneamollissima)美洲栗(C.dentata）和冈尼按(Eucalyptusganni)蓝按(E.globulus)。,回交群体与F2代群体相似，群体具有永久性质。尤其适用于利用显性标记作图，分析简单。但与F2代群体相比，降低了可检测的位点数。,F1代群体利用F1代群体开展林木遗传图谱的构建，对于加速林木图谱构建研究进程具有重要意义。现已利用F1代群体进行作图的树种有：巨按(Eucalypusgrandis)尾叶按(E.europhylla)；火炬松（Pinustaeda)；响叶杨（Populusadenopoda)银白杨（P.alba）等。,F1代群体适合于杂合度较高的树种。可同时利用共分离分析和分离个体混合分析法进行基因定位，建群时间短。缺点是，增加筛选引物和探针的工作量。,单倍体作图群体利用大配子体，显性标记与共显性标记具有相同的遗传行为，且在亲本未知的情况下，可以发现连锁在子代中的分布。因而可以快速作图。但是，由于从单个大配子体中无法分离大量的DNA，所以不适用于对DNA要求量大的分子标记。,已构建单倍体分离群体的树种有：短叶红豆杉；白云杉；欧洲云杉；辐射松；土耳其松；北美乔松；马尾松等,利用大配子体作图是大多数针叶树可以采用的群体。因为大配子体是纯合单倍体，而且分析简便，不需专门建群。但是暂时性群体，作图与定位不能同时进行，应用有一定局限性。,（3）作图群体大小,作图群体的大小是影响作图精度和图谱的应用范围的一个重要条件，群体越小，图谱精度越低，图谱的分辨力越差。估算2个基因座位间的遗传距离以多大的群体为宜，主要取决于下面几个因素：群体类型；基因座位间的连锁状态（相引或相斥）；标记的分离情况；基因座位间的距离。,如果从作图效率考虑，作图群体所需样本容量，一是从随机分离结果可辨别的最大图距，二是2个标记间可以检测到重组的最小图距。作图群体越大，检测到重组的最小图距越小，可辨别的最大图距越大，即可以将标记定位得更为紧密，同时也可发现更为松弛的连锁。,(1)质量性状质量性状通常是由单个和几个基因控制，所以利用分子标记来定位，识辨目标基因及对目标性状的植株进行直观的选择相对比较简单。只要寻找与目标基因紧密连锁的分子标记即可。连锁的紧密程度越高，结果越可靠。,2林木基因的定位,杨树抗锈病基因的定位研究进展较大，美国的Newcombe等（1996）和Villar等（1996）分别利用不同的方法对美洲黑杨的抗锈病基因进行了研究，共发现8个与抗锈病基因紧密连锁的标记，包括一个RFLP标记，一个SSR标记，3个RAPD标记及3个AFLP标记，这些标记在研究杨树的抗病基因定位及抗病基因在杨树基因组中的分布具有潜在的应用价值。,(2)数量性状数量性状基因定位（quantitativetraillocus)，简称QTL定位。是阐明控制有关数量性状的主要基因数目，这些基因在染色体上的位置，以及其各自效应和联合效应的遗传图。,林木QTLs定位中遗传群体的类型林木作图群体进行QTLs分析时，可分为拟近交系谱（inbred-likepedigree）和纯远交系谱（(trulyoutbredpedigree)。,拟近交系谱主要包括拟F2代系谱（F2-like）和拟回交系谱（BC-like)。种间两高度杂合的亲本（Pl,P2）杂交产生第一子代群体（Fl),2个F1代全同胞交配或1个F1代个体回交于亲本Pl或P2产生第二子代群体（拟F2或拟BC群体）。,纯远交系谱(1)种间F1代设计种间2个高度杂合的亲本（Pl,P2）杂交产生全同胞F1代家系，继而进行无性繁殖。,这类设计适合于全同胞交配困难、无性繁殖容易且杂种优势明显的树种，如巨按(Eucalyptusgrandis)尾叶按(E.urophylla)（Grattapaglia等1995）。,(2）三代全同胞系谱作图群体的两亲本（Pl,P2）及P1的亲本GP11,GP12,P2的亲本GP21,GP22均存在，其中4个祖亲无亲缘关系，因而P1与P2也无亲缘关系。,美国华盛顿大学通过对杨树遗传图谱的构建，在232个RFLP标记和111个RAPD标记组成的图谱上，进行了重要数量性状如树高、胸径、材积、干形和分枝角的QTL定位，进而研究控制数量性状的多基因数目及单基因的作用效应等。例如材积生长性状，根据苗木在田间生长表现，发现大部分变异是受4个QTL控制，占遗传变异的86%，这说明控制材积性状的多基因中，实质上有86是由4个基因支配的。,QTL定位的统计方法主要包括：单一标记定位法、区间作图法和复合区间作图法等,3分子标记辅助育种,分子标记辅助育种是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在。它不受其他基因效应和环境因素的影响，结果可靠，同时可在早期进行选择，大大缩短育种周期。,分子标记辅助选择需要如下基本条件：分子标记与目标基因的遗传距离很小（一般应小于5cM）或者是共分离的；DNA的提取方法简便自动化，已适用于大群体分析；分子标记尽可能转化为PCR标记；建立多数据处理的分析软件。,（1）质量性状的分子标记辅助育种很多性状表现为质量性状遗传的特点，最常见的有抗病性、抗虫性，通过与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记，是进行质量性状选择的有效途径。,一是分离群体分组分析法（BSA）：该方法是将F2代分离群体中研究的目标性状根据其表型（如抗病、感病）分成2组，混合提取DNA，并用作模板进行RAPD分析。,二是利用遗传图谱发现目标基因被定位在某一染色体上，就可选择被分散在染色体上不同位点的标记逐渐逼近，这样便可找到该基因的分子标记。,（2）数量性状的分子标记辅助育种筛选与多基因控制的数量性状连锁的分子标记要比筛选与单基因性状连锁的分子标记复杂的多，取决于分子标记连锁图的饱和程度和度量QTL的准确程度、QTL的有效分解、准确鉴定和定位。,Neal(1991）构建了具有100个RFLP标记和190个RAPD标记的火炬松连锁图谱。并应用火炬松的连锁图谱进行了木材密度QTLs研究。他们利用区间作图法，在分子标记分布均匀，标记间隔20cM左右的连锁图上发现控制木材密度的QTLs。然后利用更详细的连锁图谱确定木材密度QTLs两侧连锁紧密的分子标记。可以对火炬松木材密度进行早期测定。,分子标记辅助选择目前尚未广泛应用，主要原因是基因作图的速度相当缓慢，分子标记的数量较少，林木上的分子标记数量更加少。,但是，随着分子标记技术在林木遗传育种中的广泛使用，分子标记连锁图的日趋饱和，与目标性状紧密连锁的分子标记数量的增多，分子标记实验成本的降低，分子标记辅助选择在林木育种中会起到重要的作用。,一些重要性状的分子标记与目标性状间的距离仍较大；分子标记在不同的遗传背景中表现不稳定，特别是数量性状遗传的重要性状的分子标记极易受遗传背景的影响；分子标记辅助选择所需要的实验设备及实验费用很高，增加了选择成本。,二、基因工程在林木育种中的应用,基因工程（geneticengineering）也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是在分子遗传学的理论指导下用类似工程设计的方法，预先设计蓝图，通过DNA拼接技术，将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种的遗传学技术。,（一）植物基因工程基本步骤1、目的基因的分离和鉴定获取目的基因的途径有直接分离和人工合成法。,2、植物表达载体的构建目的基因被分离后，往往需要经过修饰才能应用于植物基因工程。因为，外源基因插人受体基因后，其表达过程受基因转录、转录后加工、翻译及翻译后加工等一系列步骤影响。因此，主动修饰目的基因，构建植物表达载体是植物基因工程必不可少的步骤。,植物基因分离技术：PCR技术、转座子示踪技术、基因组相减技术和染色体步查技术等。,3、植物细胞的遗传转化植物遗传转化是利用生物及物理化学等手段，将外源基因导入植物细胞以获得转基因植株的技术。,一是以载体为媒介的基因转化系统，如以农杆菌Ti质粒及Ri质粒为载体的转化方法；二是DNA直接转化系统，如聚乙二醇（PEG）法、电击法、基因枪法和花粉管通道法。,标记基因在植物遗传转化过程中的作用是区分转化和非转化细胞，是筛选和鉴定转化的细胞、组织和转基因植株的有效方法。目前被广泛应用的标记基因大致可分为选择基因、报告基因两类。,5、转基因植物的鉴定以及外源基因表达的检测转基因植株的分子检测主要包括PCR特异扩增、分子杂交技术。PCR特异扩增目的基因片段是当今用于转基因植物鉴定的所用的最简单、最常用的方法。,4、转化植物细胞的筛选植物细胞经过目的基因转化处理后，只有少数细胞被转化，需将转化细胞与未转化细胞区分开来，并淘汰未转化的细胞，然后利用植物细胞的全能性在适当的环境条件下使转化细胞发育为转基因植株。,（二）基因工程技术在林木育种中的应用,1986年Parson等首次证实杨树可以进行遗传转化和外源基因能在树木细胞中表达。目前已有杨树、恺木、核桃、刺槐、麻栋、按树、火炬松、花旗松、欧洲赤松、白云杉、挪威云杉等10科22属35种进行遗传转化研究，获得转目的基因植株有杨树、松树、柳树、核桃等，个别已进人商业化阶段。,河北农业大学将Bt基因和慈菇蛋白酶抑制剂基因构建在一个植物表达载体上，通过根癌农杆菌介导将此表达载体上的双基因转人白杨优良杂种741杨中，获得了对杨扇舟蛾、舞毒蛾、美国白蛾等鳞翅目害虫具高抗性的植株。转基因植株的幼虫死亡率达到80以上，存活幼虫生长发育受到明显抑制，植株生长发育未受影响，现进人商品化生产阶段。,1抗虫基因工程,美国威斯康星麦迪逊大学等单位合作成功地将抗虫的苏云金杆菌内毒素基因和蛋白酶抑制剂基因转人白云杉树中，从而可有效地防治云杉卷叶蛾对白云杉的危害。,2抗病基因工程抗病基因根据其作用对象可分为：抗病毒基因、抗真菌基因和抗细菌基因。在林业上，抗病毒基因工程研究起步较晚，目前使用的只有杨树花叶病毒外壳蛋白（PMV一CP）基因、洋李痘病毒