羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程

ICS65.120B 46DB37山东省地方标准DB 37/ XXXXXXXXX羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程Technical specification for detection of sheep clostridium perfringens by PCR and ELISAXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/ XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、闫振贵、彭军、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、曹振山、王敏、王世荣、郝长宝。8羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程1 范围本标准规定了羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测方法的技术规范。 本标准适用于羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 14925实验动物环境及设施3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1一抗酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与包被的抗原结合的抗体称为一抗。阴阳性血清和待检血清统称为一抗。3.2二抗酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与一抗结合的抗抗体称为二抗。本标准中兔抗羊IgG抗体为二抗。4 试剂或材料4.1 产气荚膜梭菌使用A型产气荚膜梭菌标准株CVCC41。4.2 产气荚膜梭菌阳性血清羊经免疫产气荚膜梭菌抗原3次后获得的血清，每次免疫间隔两周。抗体中和试验检测效价高于1:256（附录A）。4.3 阴性血清从健康的未感染未免疫的羊分离的血清（附录A）。4.4 生化试剂灭菌0.5%石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCL、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制方法见附录B）；PCR buffer；dNTP；Taq 聚合酶；溴酚蓝；二甲苯青；蔗糖；Tris-乙酸；乙二胺四乙酸（EDTA）；溴化乙锭；琼脂糖；Tween-20；考马斯亮蓝G-250；考马斯亮蓝R-250；邻苯二胺（OPD）；30%丙烯酰胺；十二烷基硫酸钠（SDS）；过硫酸铵（AP）；四甲基乙二胺（TEMED）；甲醛溶液；FT培养基；产毒培养基；酵母浸膏粉；蛋白胨；L-精氨酸；糊精。 4.5 水试验用水符合GB/T 6682三级水的规定。5 仪器设备 5.1 微量移液器：量程为20 L100 L。5.2 PCR管：200 L体积。5.3 灭菌吸管：1.0 mL。5.4 恒温培养箱。5.5 匀速振荡器。5.6 离心机：转速不低于16000 r/min。5.7 96孔ELISA酶标板。5.8 PCR仪。5.9 酶标仪：波长范围340 nm850 nm。5.10 分光光度计。5.11 玻璃比色皿。6 产气荚膜梭菌PCR检测方法6.1 本检测方法在200 L的离心管中进行，所使用的引物如下：表1 产气荚膜梭菌PCR引物序列PrimersPrimer sequence (5-3)Size (bp)CPA-FTATGAATGGCAAAGAGGA589CPA-RACTAAAATACTGACCTTC6.2 所用的上样缓冲液为：质量/体积比为0.25的溴酚蓝，质量/体积比为0.25%的二甲苯青，质量/体积比为40%的蔗糖水溶液。6.3 所用的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶为由0.04 M的Tris-乙酸和0.001M的乙二胺四乙酸（EDTA）组成的TAE缓冲液配制的，其中含0.5 g/mL的溴化乙锭和质量/体积比为1.5%琼脂糖。6.4 试验步骤如下：a) 将过夜培养的病原菌，采用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提细菌的基因组DNA；b) 以上述细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体系（50 L）为：10PCR buffer（含Mg2+）5.0 L、2.5 mmol/L dNTP 4.0 L、Taq 聚合酶0.3 L、模板为2.0 L、引物浓度为10 pmol/L，用补齐至50 L；c) PCR扩增反应条件为：预变性94 7 min；94 变性30 s、56 退火30 s、72 延伸45 s，30个循环；产物末端72延伸10 min；d) PCR扩增产物加入上样缓冲液后，再加样于含0.5 g/mL溴化乙锭的1.5琼脂糖凝胶中，进行琼脂糖凝胶电泳检测。6.5 结果判定紫外成像仪下观察PCR产物凝胶电泳，如果出现589 bp的目的条带（如图1），则判定为产气荚膜梭菌。图1 PCR目的条带图示注： M代表 DNA Marker；1, 2, 3, 4代表检测样本。7 ELISA检测方法7.1 包被包被：将产气荚膜梭菌毒素蛋白用包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释成10 g/mL，包被酶标板。7.2 封闭用PBST洗涤酶标板5次。每孔加入封闭液（含1% BSA的PBS）200 L，置于湿盒内，4封闭过夜。7.3 一抗孵育用PBST洗涤酶标板5次。取1孔加入1:10倍稀释羊抗产气荚膜梭菌毒素高免血清作为阳性对照（制备方法见附录B），取1孔加入1:10倍稀释的羊阴性血清作为阴性对照（制备方法见附录B）；其它孔加1:10稀释的待检血清，置湿盒内37作用60 min。抗体稀释液为1 BSA的PBS。7.4 二抗孵育用PBST洗涤酶标板5次。加入1:5000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG（抗体稀释液为1 BSA的PBS），置湿盒内37作用45 min。7.5 底物显色用PBST洗涤酶标板5次。加底物反应液，置湿盒内37避光显色20 min。7.6 读数 最后用2.0 mol/L的H2SO4溶液终止反应，以酶标仪检测样品的OD490值。7.7 结果判定以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判为阳性，重复3次计算平均值。AA附录A （资料性附录）羊产气荚膜梭菌毒素的提取和抗血清的制备A.1 羊产气荚膜梭菌毒素蛋白的提取 A.1.1 将保存的羊A型产气荚膜梭菌标准株（CVCC41）接种于200 mL FT培养基中进行增菌，37厌氧培养 12 h。A.1.2 将增菌液以5%的比例接种到产毒培养基（配制方法见附录A）中，43厌氧培养 5 h-6 h 进行产毒。产毒结束，离心（12000 r/min，30 min） 取上清，离心后用 0.22 m 的滤器过滤取上清。A.1.3 将过饱和硫酸铵溶液缓慢加入到上述所制得上清中，使其终浓度达到40%，4静置过夜。A.1.4 离心（10000 r/min，20 min）保留沉淀，用同体积的含2% Triton X-100的Tris-MgCL2缓冲液溶解。A.1.5 溶解完成后，向管内加入过饱和硫酸铵溶液使其终浓度为40%，再次离心方法同上，最后取 3.0 mL 0.05M 的Tris-HCL 缓冲液（PH=7.5）溶解沉淀。A.2 羊产气荚膜梭菌毒素蛋白含量测定 A.2.1 采用Bradford方法，具体操作步骤如下：a) 取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组，分别加入样品、水和试剂，即用1.0 mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0 mL、0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.1 mL，然后用无离子水补充到0.1 mL；b) 最后各试管中分别加入5.0 mL考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（不能太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）；c) 加完试剂2 min-5 min后，即可开始用玻璃比色皿，在分光光度计上测定各样品在595 nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1 mL水加5.0 mL 考马斯亮兰G-250试剂。比色皿使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡；d) 用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5 mg牛血清蛋白/mL溶液的A595约为0.50。A.2.2 微量法：当样品中蛋白质浓度较稀时（10 mg/mL-100 mg/mL），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5 mL或1.0 mL，空白对照则分别为0.5 mL或1.0 mL水，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0 mL, 同时作相应的标准曲线，测定595 nm的光吸收值。0.05 mg牛血清蛋白/mL溶液的A595约为0.29。A.3 羊产气荚膜梭菌毒素聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测A.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）采用解离非连续缓冲系统垂直板电泳。A.3.2 使用浓缩胶为5%，分离胶为12%的不连续聚丙烯酰胺凝胶（附录B）。A.3.3 电泳结束，采用考马斯亮蓝R-250染色，以标准低蛋白分子量的对数值和电泳迁移率绘制标准曲线，求出各蛋白分子量。A.4 产气荚膜梭菌毒素抗血清的制备 A.4.1 将甲醛缓慢的加入到含有毒素的溶液中使甲醛终浓度达到 0.3%，混匀后，在37条件下将外毒素灭活 96 h，期间每隔 5 h-6 h 振荡一次混合液。A.4.2 将灭活的羊产气荚膜梭菌毒素蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化，制备羊产气荚膜梭菌毒素免疫用抗原。A.4.3 选取15 kg左右的健康未感染未免疫的羊2只，肌肉注射免疫毒素抗原，共免疫3次，每次间隔2周，毒素免疫剂量为10 mg/只/次。饲养环境饲养符合GB 14925实验动物环境及设施国家标准的要求。A.4.4 最后1次免疫后7 d采血，抗体中和试验检测血清中羊抗羊产气荚膜梭菌毒素抗体的效价，效价高于1：256以上时采血，分离血清，-20保存备用。A.5 阴性血清制备采集健康未感染过产气荚膜梭菌的羊，制备阴性血清。BB附录B （规范性附录）溶液的配制B.1 灭菌0.5%石炭酸生理盐水的配制称取9.0 g氯化钠（NaCl）溶于水，定容到1.0 L，再加入5.0 mL苯酚。配制后高压灭菌器灭菌后使用。B.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制1 mol/L PBS（pH 7.2）的配方如下：a) 氯化钠（NaCL）： 8.0 g；b) 氯化钾（KCL）：0.2 g；c) 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44 g；d) 磷酸二氢钾(KH2PO4) ：0.24 g；e) 加水900 mL，调pH等于7.2，定容至1000 mL。B.3 PBST缓冲液的配制1.0 L PBS + 1.0 mL Tween-20。B.4 牛血清白蛋白（BSA）将100 mg的牛血清白蛋白加入9.5 mL水中（须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白中），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清白蛋白完全溶解为止。加水定容到10 mL，然后分装成小份，贮存于-20。B.5 Tris-HcL缓冲液的配制配方如下：a) Tris 碱 ：121.1 g；b) 浓盐酸（1mol/L HCl）：42.0 mL；c) 水：定容至1000 mL。在900 mL水中加入121.1g Tris 碱，溶液冷却至室温后调节溶液pH值至8.0，然后定容至1000 mL，分装后高压蒸汽灭菌30 min，室温保存。 B.6 5%浓缩胶配制配方如下：a) 水：2.1 mL；b) 30%丙烯酰胺：0.5 mL；c) 1.0M Tris-HCL buffer：0.38 mL；d) 10%SDS：0.03 mL；e) 10%过硫酸铵（AP）： 0.03 mL；f) TEMED：0.003 mL。B.7 12%分离胶配制配方如下