目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定

目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的PCRPCR扩增扩增扩增扩增 及其扩增产物的鉴定分析及其扩增产物的鉴定分析及其扩增产物的鉴定分析及其扩增产物的鉴定分析 此实验共包括如下六个部分此实验共包括如下六个部分 1. 第一部分，目的基因选择1. 第一部分，目的基因选择 2. 第二部分，PCR引物设计2. 第二部分，PCR引物设计 3. 第三部分，PCR实验操作3. 第三部分，PCR实验操作 4. 第四部分，PCR产物电泳鉴定4. 第四部分，PCR产物电泳鉴定 5. 第五部分，PCR产物测序鉴定5. 第五部分，PCR产物测序鉴定 6. 第六部分，目的基因序列变异分析6. 第六部分，目的基因序列变异分析 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 第一部分，目的基因选择第一部分，目的基因选择 候选基因简介候选基因简介 ?在本实验中，有三个候选基因，分别是在本实验中，有三个候选基因，分别是NGAL，Fascin和和Ezrin。 ?这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿瘤的发生发展中这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿瘤的发生发展中 起重要的生物学作用。起重要的生物学作用。 ?汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行 了深入研究，在国外杂志上发表了深入研究，在国外杂志上发表SCI收录研究论文收录研究论文20余篇，已形成系列优势。余篇，已形成系列优势。 ?同学们可查阅相关资料，选择感兴趣的基因来做同学们可查阅相关资料，选择感兴趣的基因来做PCR实验。实验。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?NGAL（neutrophil gelatinase- associated lipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载 蛋白，是脂质运载蛋白（蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin) 家族的一个成员。家族的一个成员。 ?NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶- 9的活性，作为小分子铁配合物结的活性，作为小分子铁配合物结 合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，NGAL作为一种早期标志物还可作为一种早期标志物还可 以帮助判定缺血性肾损伤程度。以帮助判定缺血性肾损伤程度。 ?NGAL的的mRNA信息在信息在NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完 整编码区的有整编码区的有BC033089和和NM_005564等，编码区长为等，编码区长为597 bp，编码，编码198个氨基酸，包含个氨基酸，包含 了了N端前部长为端前部长为20个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的1- 60 bp）。）。 NGAL 基因基因 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列核酸编码区序列及其相应的蛋白序列： 前前20个个AA 为信号肽序为信号肽序 列列 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 2001年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞 系系SHEE 和食管癌细胞系和食管癌细胞系SHEEC 互为对照，用互为对照，用cDNA 微列阵进行筛选，用微列阵进行筛选，用RNA 印迹和印迹和RT- PCR 进行鉴定，进行鉴定，cDNA 克隆测序后与克隆测序后与GenBank 进行进行BLAST 分析比较。结果表明分析比较。结果表明NGAL 基基 因在因在SHEEC中出现显著差异过表达，其中出现显著差异过表达，其cDNA 序列与小鼠序列与小鼠24p3、大鼠、大鼠NRL (neu- related lipocalin) 和人中性粒细胞和人中性粒细胞NGAL 具有较高的相似性。这提示具有较高的相似性。这提示NGAL 基因在永生化食管上皮基因在永生化食管上皮 细胞恶性转化中可能发挥着重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。细胞恶性转化中可能发挥着重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。 A B 利用利用cDNA 芯片筛选两种细胞的差异表达基因芯片筛选两种细胞的差异表达基因 A.永生化食管上皮细胞系永生化食管上皮细胞系SHEE B.食管癌细胞系食管癌细胞系SHEEC A B C 反转录反转录PCR检测检测NGAL在两种细胞的在两种细胞的mRNA水平水平 A.永生化食管上皮细胞系永生化食管上皮细胞系SHEE B.食管癌细胞系食管癌细胞系SHEEC C. 100 bp DNA marker 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?Fascin蛋白的蛋白的mRNA全长为全长为2767bp，由，由5端非翻译区端非翻译区111bp碱基，碱基，3端非翻译区端非翻译区1174bp 碱基，碱基，1482bp的全编码序列区和的全编码序列区和6个个PloyA信号肽组成，编码信号肽组成，编码493个氨基酸，分子量约为个氨基酸，分子量约为 55kD。 ?Fascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)，边缘的丝状伪足，边缘的丝状伪足(filopodia)、 微棘微棘(microspikes)的核心肌动蛋白束中。的核心肌动蛋白束中。 ?以往研究发现，以往研究发现，Fascin基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌Hela、胃癌、胃癌AGS、 大肠癌大肠癌LM1215和和SW480、胰腺癌、胰腺癌BxPC3和和T3H4等细胞系中均上调表达。等细胞系中均上调表达。 ?细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密切关系，提示细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密切关系，提示Fascin蛋白可能蛋白可能 在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。 Fascin 基因基因 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGAC GGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAG CAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACA AGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGAC GGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGC GCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCA CCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGG CGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGC GCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGT GGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCC ACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACG AGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTC CAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGC CACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGC GCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAG ACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGG CTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGT TCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACC AGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGG GCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGG GAGTACTAG MTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDG NVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYA HLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRY LAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCA FRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINR PIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKV AIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEY Fascin基因的编码区序列基因的编码区序列 Fascin基因的蛋白序列基因的蛋白序列 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 Fascin蛋白的三级结构：由蛋白的三级结构：由4个个- 三叶草结构组成，含多个折叠三叶草结构组成，含多个折叠 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?我们课题组发现，在永生化食管上皮细胞我们课题组发现，在永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞向食管癌细胞SHEEmt的恶性转化中，的恶性转化中， Fascin基因呈现上调表达，并且在食管癌组织中也检测到基因呈现上调表达，并且在食管癌组织中也检测到Fascin蛋白呈阳性表达。蛋白呈阳性表达。 ?Fascin在食管癌中的具体功能以及过表达的机制至今仍没有得到很好的阐明。为此我们在食管癌中的具体功能以及过表达的机制至今仍没有得到很好的阐明。为此我们 设计并合成了靶向设计并合成了靶向Fascin基因的基因的siRNA，试图通过，试图通过RNA干扰的方法减少干扰的方法减少Fascin基因的表基因的表 达，从而探讨达，从而探讨Fascin对肿瘤的分化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。对肿瘤的分化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。 扫描扫描电电镜镜结结果显示果显示抑制抑制Fascin表达表达后后，EC109细胞细胞突触突触形成形成明明显显减少减少。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 细胞免疫荧光结果显示代表细胞免疫荧光结果显示代表Fascin蛋白的绿色荧蛋白的绿色荧 光在被干扰细胞（光在被干扰细胞（A）中要比对照细胞（）中要比对照细胞（B）的弱）的弱 AB 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 Ezrin基因基因 ?Ezrin为为ERM（Ezrin,radixin,moesin ）蛋白家族成员之一，）蛋白家族成员之一，ERM家族成员大多位于丝状突家族成员大多位于丝状突 和膜伸展部位，基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜和将膜蛋白锚定在特定的部位，这样和膜伸展部位，基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜和将膜蛋白锚定在特定的部位，这样 可维持细胞膜表面的一些特殊结构，如微绒毛和细胞膜突起等。可维持细胞膜表面的一些特殊结构，如微绒毛和细胞膜突起等。 ?ERM家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位，通过细胞与细胞、细胞与基质之间的相互家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位，通过细胞与细胞、细胞与基质之间的相互 作用参与细胞粘附作用降。作用参与细胞粘附作用降。 ?ERM家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体，并通过家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体，并通过Rho- GTP酶参与信号转导。酶参与信号转导。 ?Ezrin含有含有585个氨基酸，等电点为个氨基酸，等电点为6.15，理论分子量为，理论分子量为69kD。Ezrin分子带有大量电荷分子带有大量电荷 （38.5%的氨基酸残基带电荷），这可能是导致它的理论分子量与实际分子量不同的原因的氨基酸残基带电荷），这可能是导致它的理论分子量与实际分子量不同的原因 （Ezrin实际分子量为实际分子量为80kD）。）。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 Ezrin定位与染色体定位与染色体6q25.2- q26，DNA长度为长度为1761个碱基，含个碱基，含13个外显子。个外显子。 ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAA ACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAG GATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTC CGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAA GGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGT TTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAG CACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGC TATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAA CAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTT CCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTT TGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCC GCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGG CAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT GATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGC AGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAG GAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAA GATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGG ATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCG GTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGG CATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGC TGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAA GGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAA Ezrin的编码区序列的编码区序列 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 Ezrin蛋白含有四个功能域蛋白含有四个功能域 586 299 206 86 终点终点功能功能起始起始名称名称 结合胞浆蛋白结合胞浆蛋白338ERM 210FERM_C 88FERM_M将胞浆蛋白连接到膜上将胞浆蛋白连接到膜上 9FERM_N 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 我们课题组发现我们课题组发现Ezrin在食管癌及切缘食管粘膜组织中的位置分布有胞膜分布、胞浆分布在食管癌及切缘食管粘膜组织中的位置分布有胞膜分布、胞浆分布 和胞膜胞浆混合分布等三种模式。恶性程度越高的癌细胞越易具有胞浆分布模式，说明和胞膜胞浆混合分布等三种模式。恶性程度越高的癌细胞越易具有胞浆分布模式，说明 Ezrin细胞定位的变化可能在食管癌的发生发展过程中发挥重要作用。细胞定位的变化可能在食管癌的发生发展过程中发挥重要作用。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 第二部分，第二部分，PCR引物设计引物设计 引物决定了引物决定了PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如primer premier5、 Oligo和北京军事医学科学院李伍举教授开发的和北京军事医学科学院李伍举教授开发的Biosun等，等，Internet免费引物设计网站有免费引物设计网站有 primer 3，Primerfinder等。等。 引物设计有以下几个原则：引物设计有以下几个原则： （1）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过（1）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过 70的同源性或连续8个的碱基互补，减少非特异产物；70的同源性或连续8个的碱基互补，减少非特异产物； （2）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在5（2）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在5端额外增端额外增 加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以1824 bp为佳。加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以1824 bp为佳。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 （3）引物）引物3末端的碱基。引物末端的碱基。引物3末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个 碱基是碱基是A时，容易发生错配，所以引物时，容易发生错配，所以引物3末端最好不要为末端最好不要为A； （4）引物的）引物的G+C含量一般为含量一般为4060，过高或过低都不利于引发反应；，过高或过低都不利于引发反应； （5）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会 影响引物与模板的结合。影响引物与模板的结合。 （6）两条引物的融解温度）两条引物的融解温度Tm值尽量不要相差太大，引物的值尽量不要相差太大，引物的Tm值粗略计算公式为值粗略计算公式为Tm = 4 （G+C）+2（A+T）；）； （7）引物的）引物的5端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物5 端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物3端是延伸的开始，不能进行任何端是延伸的开始，不能进行任何 修饰。修饰。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 引物设计软件引物设计软件primer premier 5.0的使用的使用 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 可通过两个方法将序列输入软件中可通过两个方法将序列输入软件中 在表中粘贴序列在表中粘贴序列 打开原有的序列文件打开原有的序列文件 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 选择序列文选择序列文 件所在位置件所在位置 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?在对话框中输入待扩增序列在对话框中输入待扩增序列 ?点击左上角的点击左上角的“Primer”按钮按钮 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构引物自身是否会形成发夹结构 ?Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体同一种引物是否会形成二聚体 ?False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对引物在待扩增序列中其他位置是否有配对 ?Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体正向与反向引物间是否会形成二聚体 引物设计界面引物设计界面 正正向向和和 反反向向引引 物的物的互互 换换 正正向向和和反反向向 引物的引物的评价评价 正正向向和和反反向向 引物的引物的信息信息 每每点点击左击左 边边红红色色的的 按钮按钮，就就 出现出现相应相应 的的内内容容 对对正正向向和和反反向向引物引物进行进行编编辑辑 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 可对引物进行增加或减少碱基可对引物进行增加或减少碱基 用用键盘键盘输输入了入了5 5个个碱碱基基 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 引物的引物的信息信息 改改动动后后引物的引物的信息信息 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 重新回到双引物的界面重新回到双引物的界面 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 “Edit”“Copy”“Sense Primer” 5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3 输出引物序列输出引物序列 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?了解并掌握了解并掌握PCR基因扩增的基本原理基因扩增的基本原理 ?熟悉熟悉PCR基因扩增技术的具体操作过程基因扩增技术的具体操作过程 实验目的实验目的 第三部分，第三部分，PCR实验操作实验操作 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 一、概述一、概述 ?PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成 酶和四种脱氧核糖核合成 酶和四种脱氧核糖核 酸进行酸进行DNA的体外合成反应。的体外合成反应。 ?PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获 得多达几百万拷贝的目的基因。得多达几百万拷贝的目的基因。 ?该技术在上个世纪该技术在上个世纪80年代中期由美国年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包括多发明建立，经过近二十年已发展成包括多 种衍生技术，在很多领域中广泛使用，种衍生技术，在很多领域中广泛使用，K.Mullis也因此获得也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。年度的诺贝尔化学奖。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 二、二、PCR基本原理基本原理 ?DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 DNA聚合酶、聚合酶、 DNA连接酶、引发酶、连接酶、引发酶、RNA引物、四种脱氧核糖核酸、引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境等超螺旋酶、离子环境等 多成份参与的过程。多成份参与的过程。 ?PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个复制，所以在一个PCR中必中必 需成分是需成分是 1. 模板模板DNA 2. DNA聚合酶聚合酶 3. 四种脱氧核糖核酸四种脱氧核糖核酸 4. 正向和反向两条引物正向和反向两条引物 5. 适当的缓冲体系。适当的缓冲体系。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?模板序列：待扩增的模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链的序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋可包括线形双螺旋DNA，如基，如基 因组因组DNA，及闭环双链，及闭环双链DNA，如质粒；，如质粒； ?模板的来源很广，如从细胞模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组细菌中提取基因组DNA、提取、提取mRNA经反转录得到经反转录得到 cDNA、质粒、病毒等；、质粒、病毒等； ?每个反应中模板的量为每个反应中模板的量为1 ng1 g。质粒。质粒DNA和纯化的和纯化的DNA的量可少一些，而基的量可少一些，而基 因组因组DNA的量应多一些。的量应多一些。 ?PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致PCR 的非特异性扩增。的非特异性扩增。 1、模板、模板DNA 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?引物（引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为反应需要两种引物，分别成为5端引端引 物和物和3端引物，或称为正向引物和反向引物。端引物，或称为正向引物和反向引物。 ?通常通常DNA及及mRNA序列的写法为序列的写法为53，所以，所以5端引物与目的序列的端引物与目的序列的5末端序列相末端序列相 同，而同，而3端引物与目的序列的端引物与目的序列的3末端序列反向互补。末端序列反向互补。 2、引物2、引物 ?它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。 ?为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有1518 bp。为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有1518 bp。 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 上上游游引物引物 下下游游引物引物 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?DNA聚合酶：以聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。的一种酶。 ?早期的早期的PCR反应使用的反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段。但该酶在高温片段。但该酶在高温 下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。 ?随着新的耐热随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使反应中的应用，使PCR操作更方便，产量更稳定。操作更方便，产量更稳定。 ?目前商品化的目前商品化的DNA聚合酶有聚合酶有Taq DNA聚合酶和聚合酶和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。 ?Taq DNA聚合酶最适工作温度为聚合酶最适工作温度为75- 80。该酶具有。该酶具有53聚合酶活性，在镁离子存在情聚合酶活性，在镁离子存在情 况下可催化核苷酸沿况下可催化核苷酸沿53方向发生聚合反应。方向发生聚合反应。 3、DNA聚合酶聚合酶 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 4、脱氧核糖核酸4、脱氧核糖核酸 ?四种脱氧核苷三磷酸即四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和和dGTP，为，为PCR反应中反应中DNA合成原料。合成原料。 ?在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种 的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?缓冲液提供缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、Tris- Cl和和MgCl2。 ?其中其中Mg2 的浓度最重要，它能影响 的浓度最重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与聚合酶的活性，以及模板与PCR产物的产物的 解链温度。解链温度。 5、缓冲液5、缓冲液 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 1.变性：是指模板的热变性，双螺旋模版变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的成为单链的DNA分子；在应用分子；在应用Taq DNA聚聚 合酶进行合酶进行PCR反应时，变性往往在反应时，变性往往在9495条件下进行。这也是条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进行聚合酶进行 30个左右的个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。 2.退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物 的熔解温度低的熔解温度低510，PCR实验要对退火温度进行优化。实验要对退火温度进行优化。 二、二、PCR基本步骤基本步骤 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 3.延伸：在镁离子存在条件下，延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加 在引物的在引物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成与模版方向生成与模版DNA互补的新互补的新DNA链。链。 双链双链模模版版DNADNA 变变性性 退火退火 5 53 3 5 53 3 5 5 5 53 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 上上游游引物引物 下下游游引物引物 延延伸伸 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 多多次循次循环环 （2 2n n 拷贝 拷贝） 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 下面为一个典型的下面为一个典型的PCR循环参数设置：循环参数设置： 备注：备注：* 比两条引物的比两条引物的Tm值低值低510。 945 min 9430 s X * 30 s 721 kb/min 725 min 25-35个循环25-35个循环 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 三、影响三、影响PCR因素因素 虽然PCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCR的特异性和高效性。虽然PCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCR的特异性和高效性。 1. 引物1. 引物 2. 变性温度和时间2. 变性温度和时间 3. 退火温度和时间3. 退火温度和时间 4. 延伸温度和时间4. 延伸温度和时间 5. 循环次数5. 循环次数 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?引物决定了引物决定了PCR产物的长度和特异性。产物的长度和特异性。 ?引物的设计要求请看本实验讲义引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计引物设计”部分。部分。 1、引物1、引物 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?在在PCR反应刚开始时，为保证作为模板的双链反应刚开始时，为保证作为模板的双链DNA完全变性成单链完全变性成单链DNA，一般设为，一般设为 95、5 min；在随后的循环中，可设为；在随后的循环中，可设为95、30s。 ?有些模板有些模板DNA的的G+C含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间 会影响会影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 2、变性温度和时间2、变性温度和时间 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 ?退火温度与引物的退火温度与引物的Tm值相关，一般比值相关，一般比Tm值低值低510。 ?退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合 而降低而降低PCR效率。效率。 ?在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法 延伸；