大肠杆菌菌种的制作及保藏

大肠杆菌菌种的制作及保藏一、实验原理1、分离原理用伊红美蓝培养基检测大肠杆菌。伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有金属光泽。从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。从而可从众多的菌落中把大肠杆菌选择出来。2、保存原理：将大肠杆菌接种到固体培养基中放入较低的温度4的冰箱中进行保藏。可保存3到6个月，用来给学生做实验很方便。二、实验材料脂10g、乳糖 10g、蒸馏水500 ml、2%伊红水溶液 10ml、0.5 %美蓝水溶液 5ml 、1mol/l的NaOH、1mol/l的HCL。2、实验器材：酒精灯、高压蒸气灭菌锅、培养皿、涂布器、锥形瓶、100ml烧杯、500ml烧杯、100ml锥形瓶、500ml锥形瓶、试管、无菌操作台、恒温培养箱。三、实验步骤：（一）制备培养基1、培养基配制：1）伊红美蓝培养基称量 蛋白胨 5g 氯化钠2.5g 琼脂10g 溶化 往烧杯中加入称量好的蛋白胨、氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其溶化。溶解后用蒸馏水定容至500 ml，调节pH值为7.6。灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋扎紧，再连同培养皿等一起放入高压灭菌锅，在压力为100KPa，温度为121条件下，灭菌15到30分钟。倒平板 冷却至60左右，再按基础培养基100 ml、20%乳糖 2ml 、2%伊红水溶液 2ml、0.5 %美蓝水溶液 1ml的比例，在无菌操作条件下加入灭菌的乳糖溶液、伊红水溶液及美蓝水溶液。摇匀后，立即倒平板。溶液中的乳糖高温下会破坏，因此一般使用压力为70KPa，温度为115的条件灭菌20min.2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏2.5g 蛋白胨 5g 氯化钠2.5g 琼脂10g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到500ml。（二）分离纯化大肠杆菌1平板划线分离法：用接种环蘸下水道溶液或土壤浸出液 后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养1020h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。 取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。 2稀释涂布分离法：先将水道溶液或土壤浸出液稀释，通常稀释到104 106之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃器涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。 划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点,都可采用。 （三）菌落培养 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37的恒温箱中培养，培养12h和24h后，培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。分别观察并记