最佳呼吸机设置的生理和病理学基础PPT课件

最佳呼吸机设置的生理和病理学基础,西京医院心血管外科ICU崔勤,为什么必须改变呼吸机设置的理念?,为什么需要肺复张治疗?,死亡率变化趋势,为什么需要改进ALI和ARDS定义?,患者特征,（ARDS定义）,急性发作在不考虑PEEP水平的情况下PaO2/FiO2200mmHg胸部正位X线或CT示双侧浸润PAWP18mmHg或无左房高压的临床证据,2.1患者特点原理：为什么不完全接受ARDS的AECC定义？,急性发作胸部正位X线或CT示双侧浸润PAWP18mmHg或无左房高压的临床证据,病毒载体非病毒载体,引起免疫反应容量小、制备困难无靶向性,裸DNA直接注射磷酸钙共沉淀脂质体,设备昂贵不适合大量细胞的转染,转染率低已很少使用,细胞毒性抑制外源基因的表达致DNA失活,纳米材料,壳聚糖的研究现状,体外转染安全高效大鼠体内实验表明半乳糖基化壳聚糖有肝靶向性大型动物体内基因转导实验尚无文献报道,研究背景,三、研究内容,研究内容,大量提取纯化质粒,chitosan,纳米微囊,体外转染7721细胞,GdCl3iv,体内注射,取主要脏器组织，检测报告基因表达,第一部分,研究内容,壳聚糖质粒DNA复合物的制备,实验方法,质粒的酶切鉴定,研究内容,图2.pEGFP-N1质粒图谱，下方为MCR,研究内容,图3.pBIND质粒图谱，右侧为其MCR,研究内容,质粒的大量提取与纯化,QiagenTMEndo-FreeplasmidGigaKits,无内毒素纯度2氯化铯梯度抽提,壳聚糖DNA复合物（纳米微囊）的制备,研究内容,质粒DNA,50mmol/LNa2SO4,0.02chitosan,Vertex(2500rpm)30s,实验结果,研究内容,12M,图4.质粒酶切产物电泳图。1为pBIND，2为pEGFP-N1，M为DNA100bpladderMarker,67bp,34bp,研究内容,M1234,图5.纳米微囊及质粒DNA电泳图。M为marker，1、3分别为pEGFP-N1，pBIND质粒DNA，2、4分别为含pEGFP-N1/pBIND的纳米微囊,壳聚糖DNA在7721肝癌细胞中的表达,研究内容,第二部分,实验方法,研究内容,细胞培养与细胞爬片制作,SMMC-7721细胞0.25胰酶消化，加1-2滴至12孔板中的盖玻片上，37孵箱放置1h，使细胞贴壁,研究内容,用壳聚糖质粒（pEGFP-N1）纳米微囊转染，以脂质体LipofectamineTM2000包裹相同的质粒作为阳性对照,转染,检测报告基因表达情况,DAPI溶液染色荧光显微镜下观察在同一视野下，分别计数绿色荧光蛋白表达的细胞数和DAPI染色的细胞数，计算转染率,研究内容,统计学分析：,所得数据处理用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，用两样本均数比较的t检验p0.05为差异有统计学意义,研究内容,实验结果,图6.7721细胞中GFP的表达200,图7.7721细胞DAPI染色200,研究内容,表1壳聚糖组和脂质体组的转染率（）,壳聚糖组,脂质体组,58.3,54.7,60.42.2*,55.61.6,分组,视野2,转染率值,*p0.05vs脂质体组,S,研究内容,视野3,视野1,62.8,60.2,57.5,54.6,讨论,本实验结果提示壳聚糖体外转染的效率略高于转染试剂脂质体，说明壳聚糖是一种有效的体外转染材料,为下一步体内实验打下良好的基础,研究内容,壳聚糖肝靶向性基因转导体内实验,研究内容,第三部分,实验方法,实验动物与分组,研究内容,杂种犬6只，第四军医大学实验动物中心随机分为2组,实验组注射壳聚糖质粒纳米微囊对照组仅注射裸质粒,术前准备,研究内容,手术前1d静脉注射氯化钆，清除Kupffer细胞,研究内容,图8.动物手术示意图,图9.动物手术图示，A为解剖肝门部，B为注射壳聚糖-DNA复合物,研究内容,A,B,研究内容,48h后处死动物，取肝、心、脾、肺、肾组织，作冰冻切片滴少许甘油碳酸盐缓冲液，放置盖玻片。置于荧光显微镜下，观察绿色荧光蛋白的表达情况,研究内容,实验结果,图10.肝组织中GFP的表达，可观察到黄绿色荧光200,A.心,B.肺,D.脾,C.肾,图11.其他组织无阳性荧光表达200,壳聚糖（chitosan）的优点,资源丰富生物可降解性无免疫原性靶向性保护DNA免受DNase的降解,研究内容,讨论,图12.壳聚糖具有肝靶向性的原理示意图,研究内容,关于壳聚糖在大型动物体内的基因转导，国内外尚无文献报道壳聚糖通过纳米微囊表面携带的正电荷与细胞膜上携带负电荷的糖蛋白及磷脂的相互作用引发细胞胞吞作用而进入细胞。而且，壳聚糖能包裹、浓缩DNA，使DNA免受DNase的降解,研究内容,经肝动脉和门静脉注射的给药途径，临床上有可行性如果用适当的功能基因替换报告基因,预期相应的基因也可以表达,并可能达到一定的治疗效果,研究内容,小结,本实验以壳聚糖与质粒制备成纳米微囊复合体，体外转染7721细胞，结果表明壳聚糖有较高的体外转染效率体内实验通过肝动脉、门静脉联合给药，在肝检测到较高的绿色荧光蛋白表达水平首次在大型动物体内完成壳聚糖介导的外源性基因表达,小结,致谢,衷心感谢我的导师窦科峰教授在学习生活过程中的照顾和教导感谢陈勇