分析化学与兴奋剂检测PPT课件

.,1,分析化学与兴奋剂检测EPO检测技术,.,2,选题背景及意义,有关马家军的新闻过去两天占据了中国各大媒体的版面，作家赵瑜撰写的马家军调查中用3万多字的文章揭露了马俊仁从1991年起逐渐给队员亲自喂服或注射兴奋剂的事实。,.,3,在1988年的汉城奥运会男子100米决赛中,加拿大运动员本约翰逊以9秒79打破了世界纪录。但72小时后,一个惊人的消息让世人目瞪口呆,药检结果报告,约翰逊使用了禁用物质康力龙(一种合成类固醇)。,掉进“药瓶子”的体坛精英们,.,4,2012年8月23日，美国反兴奋剂机构宣布剥夺阿姆斯特朗七个环法自行车赛冠军头衔，并且终身禁止其参赛。,.,5,2014年11月，马来西亚羽球名将李宗伟因误服禁药而被世界羽联处以禁赛8个月的处罚。,.,6,兴奋剂与反兴奋剂的斗争就像一场永无休止的“猫捉老鼠”的游戏，而分析化学则在这场游戏中扮演着至关重要的角色。,猫能“捉住”老鼠吗？,.,7,国际奥委会的定义：运动员应用任何形式的、或者以非正常量、或者通过不正常途径摄入的，企图以人为的和不正当的方式提高他们的竞赛能力的生理物质。按药物的性质兴奋剂可分为下述七类药物：(1)刺激剂(士的宁、苯丙胺冰毒等)(2)麻醉剂(可待因、吗啡、二醋吗啡海洛因等)(3)2-激动剂(福莫特罗、沙丁胺醇、沙美特罗和特布他林)(4)有抗雌激素作用的制剂(阿那曲唑、那洛西芬、氯米芬等,明确研究对象兴奋剂及其分类,.,8,(5)2-激动剂(福莫特罗、沙丁胺醇、沙美特罗和特布他林)(6)蛋白同化制剂(合成类固醇:雄性激素、THG等)(7)肽类激素和相关物质(促红细胞生成素EPO、生长素hGH等),.,9,EPO(促红细胞生成素)属肽类激素,是一种单链的酸性糖蛋白。完整的EPO分子由多肽和糖基构成。基本生理功能是刺激骨髓红细胞的生成和释放。,由于EPO能促进血液中红细胞数量的增加,从而提高血液的载氧能力,故EPO常被竞技体育中某些耐力项目(如长跑、自行车、游泳等)的运动员滥用,借以提高体能。,.,10,分析化学定量分析的一般流程,.,11,试样来源：运动员尿液和血液试样的处理与制备：尿液：取样前，需要将容器置于4环境；A,B两管取样.A瓶60毫升，B瓶30毫升；取样后，A瓶用做试验，B瓶封存于专门的冰箱中待用。血液：取血部位在运动员上肢肘窝处的表浅静脉；共抽取25毫升血液，分别注入4只真空样品管，分别加入适量抗凝血剂；将其分为A、B两组，编号置于样品传送盒中，立即冷冻封存。,试样的采集与处理,.,12,由于尿液和血液属于液体试样，分布比较均匀，取少量用于分析即可.尿检血检,试样的分离与富集,.,13,rhEPO(外源性EPO）检测的难点EPO在血液中含量低，正常血液中EPO的含量仅为每毫升纳克级，血液中为130230ng/mL。EPO与rhEPO结构相似，两者具有相同的氨基酸序列，仅N端所连的糖基略有区别。rhEPO半衰期短，注射后4-7天便检测不到。个体之间及个体本身不同时间、状态下的EPO浓度差异很大。,.,14,近年来陆续发展起来的EPO兴奋剂检测技术,概括起来可以分为间接法和直接法两大类。间接法原理：,分析方法的选择与分析测定,.,15,为了找出外源性EPO在体内留下的“间接性”证据,各国学者进行了大量的研究,先后提出了单指标检测和多指标检测等方案。单指标检测,.,16,单指标检测的缺陷:：个体之间的差异以及海拔、运动等因素均会使其中的一两个指标发生变化。多指标检测原理：将5个指标归并成一个统计学的模型:a:Score=3.721Hct+30.45RetHct+0.1871ln(EPO)+0.1267ln(sTfr)+0.115ln(macrocytes%+0.1)b:Score=6.149Hct-92.87RetHct-0.1463l(EPO)a式用于检测正在使用EPO的滥用者,若所得值大于2.66(男性)/2.40(女性),则可判为阳性;b式用于检测近期(24周内)停用EPO的滥用者,所得值大于2.29(男性)/2.10(女性),便可判为阳性。,.,17,多指标检测的优劣：在一定程度上防止了单一指标的片面性,然而要作为一种承担法律责任的检测指标,仍无法使人确信无疑。因为所有这些血液学参数都仅能指示红细胞的生成被促进了,但始终无法确证运动员是否真的注射了外源性EPO。间接法总结：易受个体差异、环境因素(如高原训练)影响，不能单独作为EPO检测依据。,.,18,直接法：利用各种分析方法直接追踪查找样品中的外源性EPO.凝胶电泳法：依据：rhEPO与正常内源性的EPO相比存在一个较低的负电荷。过程：借助琼脂糖凝胶柱进行电泳,再利用RIA法使各成分在阴极获得指示并检出。结果：rhEPO糖化体比正常EPO糖化体晚出峰。而且,该方法在24h以内EPO的检出率达100%,48h以内达75%.,.,19,等电聚焦电泳配以免疫双印迹化学发光方法+EPO等电聚焦电泳EPO免疫印迹法依据：rhEPO在等电聚焦电泳中会出现附加的碱性条带,而内源EPO则没有。过程：将样品进行等点聚焦电泳，将检测者的尿EPO图与正常内源EPO的图相比较,便可进行判断。结果：误检率仅为十万分之六到万分之三,是一种检测近期使用rhEPO的理想方法。,.,20,直接法优劣：直接法的出现对于EPO的兴奋剂检测是一次重大的突破,但是传统的凝胶电泳受焦耳热的限制,只能在低电场下进行操作,所以分离时间长、效率低。有实验表明在50mA的工作电流下用琼脂糖凝胶柱,分离rhEPO与EPO花了20h,这个时间对于不到10天,但拥有近万名运动员的奥运会而言,显然是太慢了。目前检测现状：间接与直接相结合,.,21,EPO的检测发展至今,不论是在临床上,还是在竞技体育中,都获得了极大的进展。一方面EPO的检测是检测肽类、蛋白类、糖蛋白类激素的一种探索,对于这些难以用常规色谱学(如GC/MS)方法检测的物质,EPO的检测是一种启发。另一方面,EPO检测也面临着新的挑战。据称已经有人开始尝试“全氟化碳(又称合成血液,通过增加单个血红细胞的载氧能力而不是增加血红细胞的数目)”以及基因EPO等模拟EPO携氧能力而设计的兴奋剂。但是EPO的检测研究并未就此止步，“猫捉老鼠”的