土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定稿ppt

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,硝化细菌是指能够氧化无机氮化物,从中获取能量,从而把二氧化碳合成为有机物的一类细菌。硝化细菌合成有机物的过程表示如下：2NH3+3O2(硝化细菌)2HNO2+2H2O+能量2HNO2+O2(硝化细菌)2HNO3+能量6CO2+6H2O(能量)C6H12O6,NH3既是硝化细菌的氮源，也是其能源。,思考：硝化细菌的新陈代谢类型是什么？,1、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,什么是选择性培养基？P22页,2、方法：,利用选择培养基分离,二、筛选菌株,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4、培养基选择分解尿素的微生物的原理,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,利用血球计数板在显微镜下计数是常用的一种微生物计数法,显微镜直接计数法其原理与计数板的构造有关每块计数板上有两个计数室（正方形），盖上盖玻片后容积是一定的（0.1mm3），深为0.1mm，边长为1mm，其上面有精确的刻度。,其刻度一般有两种规格,16个中方格，每个中方格分25个小格1625,25个中方格，每个中方格分16个小格2516,计数室,我们采用的是2516的，计数时查5个小方格的总菌数。如图：计算：1个计数室的总菌数=A/525B1g（ml）样品中的总菌数=A/525161000B=50,000AB个,5个方格的总菌数,稀释倍数,每毫升原液所含细菌总数,=,每小格平均细菌数4001000稀释倍数,注：400=2516，表示400个小格，1000表示1mL=13,取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖盖玻片。取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。用10物镜观察并将计数室移至视野中央。在10物镜下计数：计数4个（或5个）小格的菌体总数，然后求得平均值。乘上400就得出计数区总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。注意事项：计上不计下，计左不计右。,实验步骤：,不能区分死菌与活菌；,缺点：,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,稀释涂布平板法。,（3）计算：,计算公式：,每克样品中的菌株数=（CV）M,例、某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,B,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值，更具说服力，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板，培养后计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。（为什么）,例2、自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：步骤如下：a、制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液；b、为了得到更加准确的结果，应选用法接种样品；c、适宜温度下培养。结果分析：（1）测定大肠杆菌菌落数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是（）A、一个平板，统计的菌落数时230个B、两个平板，统计的菌落数分别为220和260，取平均值为240C、三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，取平均值为163D、四个平板，统计的菌落数分别为210、260、240和250，取平均值为240,稀释涂布平板法,D,（2）某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是（涂布平板时所用的稀释液体积为0.2mL）个。（3）用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量（多/少），因为。,1.06109,多,当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的是一个菌落,例：在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由2516400个小室组成，容纳液体总体积为0.1mm3。某同学操作时将1mL酵母菌样品加99mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。,(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；把酵母菌培养液放置在冰箱中；第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。请纠正该同学实验操作中的3处错误：_；_；_。,答案：应将试管轻轻震荡几次再吸取酵母菌培养液进行计算；应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养；应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据,(2)在实验前应该对计数板、吸管等器具进行处理。(3)如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是。(4)如果观察到如图所示a、b、c、d、e5个大格共80个小室内共有酵母菌48个，则上述1mL酵母菌样品中约有酵母菌个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？。,灭菌,适当稀释,2.4108,多次实验，求平均值,设置对照的主要目的是：,.设置对照：,排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,二.实验的具体操作.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,三样品的稀释,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,.取样涂布,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,如果得到了3个或3个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验。,微生物的培养与观察,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,五.课外延伸在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本课题知识小结:,六、例题解析,例1对细菌群体生长规律测定正确的表述是A在液体培养基上进行B至少接种一种细菌C接种一个细菌D及时补充消耗的营养物质,解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。,答案：A,1.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素,实践训练,C,D,3.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质C.青霉素类药物D.高浓度食盐,B,C,练一练用稀释涂布平板法来统计样品中