质粒DNA的转化

一实验名称：质粒DNA的转化二实验目的：将编码目的蛋白的质粒导入大肠杆菌体内，从而大量扩增并表达目的蛋白三实验原理：转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）四实验步骤;1.把固态培养基加热融化，由于温度较热用自来水冲洗瓶身降温（十度左右会再凝固，所以不能冲洗太久），在超净台中加入千分子一的AP（本质粒具有抗AP性，故AP能抑制别的细菌生长），然后向平皿中倒入少许（大约5毫升）培养基，表明自己名字2.到-80冰箱取出质粒（每瓶100微升，可制作两板）迅速放入冰盘保存，放入4保存30min3.将上述混合物放在42水浴锅中融化90s（据经验42度90s最适合），在超净台中用针尖沾取少许质粒放入大肠杆菌EP管内（质粒为提纯多的所以加很少，一般未提纯的加1微升），再加200微升无抗培养基，加完后放回冰盘（热：壁通透性大，冷:通透性小，起封闭作用）放入摇床15min。4. 摇完后用微量加样枪析出滴到制作好的培养皿的中央，然后慢慢铺满平皿底部（千万不能滑到边缘，由于量比较少，滑到边缘就不容易再铺），表明细菌名称，实验时间，放入4温箱隔夜保存5.观察有稀疏斑点状菌落，从4度冰箱取出培养基，在超净台中，取四支带帽试管（表有黄线者为抗AP）分别倒入培养基至黄线处；用过火的镊子夹取黄枪尖（枪尖过火要快以防烧焦）按象限沾取菌落一枚，放入试管中，注意整个过程要过火。6.将试管放入摇床中，未完待续五实验结果:六注意事项：1.培养基溶解后冲洗降温不要太久以免再凝固2.取质粒尽可能的一直放入冰盒3.42度90s 4.铺板要匀！【原理】转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。本实验采用 CaCl2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于 0 4 ， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。【试剂与器材】1 LB 液体培养基 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。2 LB 固体培养基 LB 液体培养基中加 1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。3 0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。4 氨苄青霉素 用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml 溶液，置 -20 保存。5 人 Bcl-2 重组质粒 它是 Eco R 单酶切的 pBluescript KS(-) 载体与 EcoR 单酶切的人 Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为 4 861bp ，前者是一种由 pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。因此用 Eco R 酶切则应到空载 pBluescript KS(-) 载体 (2.96kb) 和人 Bcl-2 cDNA 片段 (1.9kb) 。配制成 2g/1 l 。6 大肠杆菌 DH5 此为 DNA 扩增菌7 恒温水浴箱8 超净工作台9 高速冷冻离心机10 恒温摇床11 恒温箱12 消毒离心管13 消毒 tips14 玻璃培养皿 直径 90mm15 玻璃涂布器16 95% 乙醇17 标记笔【操作步骤】1 细菌感受态细胞的制备将 DH5 菌种划线于 LB 琼脂板上， 37 培养过夜。挑取单菌落接种于 5ml LB 培养基中， 37 振荡培养培养过夜。次日取菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培养基的烧瓶中， 37 剧烈振荡培养至约 2 3h ，待 A 600 值达到 0.3 0.4 时将烧瓶置于冰浴 10 15min 。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的 50ml 离心管中。 4 000 g ， 4 离心 10min ，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/L CaCl2 重悬菌体，置冰浴 30min 。 4 000 g ， 4 离心 10min ，弃培养基。再加 4ml 预冷的 0.1mol/L CaCl2 ，轻轻重悬菌体，置 4 冰箱 12 16h 。2 DNA 重组子的转化大肠杆菌 DH5 本实验中的 DNA 重组子为人 Bcl-2 重组质粒。在无菌条件下按每管取 200 l 新鲜感受态 DH5 细菌置于无菌的 5ml 塑料离心管中，共 2 管，分别加入人 Bcl-2 重组质粒 (10ng) 和消毒水 ( 作阴性对照 ) 各 5 l ，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min 。 42 ，热休克 90s ，中途不要摇动离心管，每管加 800 l 无抗生素的 LB 培养基，于 37 空气摇床中以 150 r/min 速度振摇 45min ，使细菌复苏。每管取 200 l 加