化妆品安全技术规范

附件二细菌恢复突变试验Bacterial Reverse Mutation Assay一个范围本规范确定了细菌突变复试的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。2定义2.1恢复突变的reverse mutation细菌在化学突变体的作用下从营养缺陷型返回原型(prototroph )。2.2基因突变gene mutation化学突变体改变细胞DNA中碱基对的序列顺序。2.3碱基置换变异base substitution mutation引起DNA链上的一个或几个碱基对的置换。碱基取代有过渡和过渡两种。转换是DNA链上的嘧啶被其他嘧啶取代，或嘌呤被其他嘌呤取代。取代是指DNA链上的嘧啶被其他嘌呤取代或嘌呤被其他嘧啶取代。2.4位移变异frameshift mutation在DNA链中引起一个或多个碱基对增加或缺失。2.5细菌恢复突变试验Bacterial reverse mutation assay应用组氨酸或色氨酸缺陷型试验菌株测定诱发细菌碱基取代或编码变异的化学物质诱发的氨基酸缺陷型原养型变异复原试验方法。2.6 S9由多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠与-萘酚结合引起的大鼠制备肝匀浆，9000g离心10min后的肝匀浆上清。3原理鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株无法合成组氨酸，因此在组氨酸不足的培养基中，自发恢复突变的细菌只有少数生长的大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株无法合成色氨酸，因此在色氨酸缺乏的培养基中，自发诱变如果突变体存在，营养缺陷型细菌就会恢复到原来的营养型，形成菌落，从而判断受试者是否是突变体。一部分变异原体经代谢活化后才会发生恢复变异，因此加入由诱导剂诱导的大鼠肝调制的S9混合液。4设备和设备培养箱、恒温水浴、振动水浴床、压力蒸汽消毒器、干燥烤箱、低温冰箱(-80)和液氮生物容器、普通冰箱、天平(精度0.1g和0.0001g )、混炼振荡器、均化器、菌落计数器、低温高速离心机、玻璃器等。5培养基和试剂5.10.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分：L-组氨酸(MW155 )78毫克D-生物素122毫克l色氨酸(MW204 )102毫克加入蒸馏水1000ml制备：加热上述成分溶解生物素，在0.068MPa下进行高压灭菌。 贮藏在4的冰箱。 在试验中不使用大肠杆菌的话，就不会添加色氨酸。5.2顶琼脂培养基成分：琼脂粉1.2g氯化钠1.0g加入蒸馏水200mL调制：将上述成分混合后，以0.103MPa高压灭菌30min。 实验中加入组氨酸0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液20mL。 在试验中不使用大肠杆菌的话，就不会添加色氨酸。5.3Vogel-Bonner (V-B )培养基e成分：柠檬酸(C6H8O7H2O)100g磷酸氢二钾(K2HPO4)500g磷酸氢铵钠(NaNH4HPO44H2O)175g硫酸镁(MgSO47H2O)10g加入蒸馏水1000mL制备：将前三种成分加热溶解后，将溶解的硫酸镁慢慢放入容量瓶中，加入蒸馏水1000mL。 0.103MPa高压灭菌30min。 贮藏在4的冰箱。5.420%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加入蒸馏水1000mL调制：加入少量蒸馏水加热溶解葡萄糖，加入蒸馏水至1000mL。 0.068MPa高压灭菌20min。 贮藏在4的冰箱。5.5底层琼脂培养基成分：琼脂粉7.5g蒸馏水480mLV-B培养基E10mL20%葡萄糖溶液10mL调制：首先，将前两种成分在0.103MPa下高压灭菌30min，然后加入后两种成分，将基底平板充分混合。 每盘制作25mL平板，凝结固化后，在37的培育箱中跌倒24小时，备用。5.6营养肉汤培养基成分：牛肉糊2.5g胰腺5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g加入500mL蒸馏水调制：将上述成分混合后，以0.103MPa高压灭菌30min。 贮藏在4的冰箱。5.7盐溶液(1.65mol/L KCl 0.4mol/L MgCl2)成分：氯化钾(KCl)61.5g氯化镁(MgCl26H2O)40.7g加入500mL蒸馏水制备：将上述成分溶解于水后，以0.103MPa高压灭菌30min。 贮藏在4的冰箱。5.80.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4 )成分：磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)2.965g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)29.015g加入500mL蒸馏水配制：溶解上述成分后，在0.103MPa下高压灭菌30min。 贮藏在4的冰箱。5.9S9混合液每成分毫升S9混合液肝脏S9100l盐溶液20l灭菌蒸馏水380l0.2mol/L磷酸盐缓冲液500l辅酶II(NADP)4mol6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mol调制：将辅酶和6-磷酸葡萄糖放入灭菌三角瓶中称量，按照与上述相反的顺序加入各种成分，将肝脏S9加入现有缓冲液的溶液中。 该混合液现已配制，应保存在冰水浴中。 实验结束后，剩下的S9混合液应该扔掉。5.10菌株鉴定用和特殊用途试剂5.10.1组氨酸-色氨酸-生物素平板成分：琼脂粉15g蒸馏水934mL(V-B )培养基E 20mL20%葡萄糖20mL灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL杀菌盐酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL调制：琼脂和水经高压灭菌后，将灭菌后的20%葡萄糖、V-B培养基、组氨酸溶液加入加热后的琼脂溶液中(试验中不使用大肠杆菌，不添加色氨酸，蒸馏水改为944ml )。 将溶液稍微冷却后，加入灭菌生物素混合，制成平板。5.10.2氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板成分：琼脂粉15g蒸馏水930mL(V-B )盐溶液20mL20%葡萄糖20mL灭菌盐酸组氨酸溶液(0.5g/100mL)10mL杀菌盐酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL氨苄青霉素溶液(8mg/mL为0.02mol/LNaOH中)3.15mL四环素溶液(8mg/mL为0.02mol/L HCl中) 0.25mL调制：琼脂和水经高压灭菌20min，无菌葡萄糖、VB盐溶液、组氨酸溶液和色氨酸溶液加入加热的琼脂溶液中混合(试验中不使用大肠杆菌不添加色氨酸的同时蒸馏水变为940ml )。 冷却至约50，在无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。应该在倒琼脂平板后的几天内做好主平板。5.10.3营养琼脂平板成分：琼脂粉7.5g营养肉汤培养基500mL制备：0.103MPa高压灭菌30min后注入平板。6试验菌株及其生物学特性鉴定6.1试验股采用下列菌株作为标准组合鼠伤寒沙门氏菌TA1535；鼠伤寒沙门氏菌TA97或TA97a或TA1537；鼠伤寒沙门氏菌TA98；鼠伤寒沙门氏菌TA100；鼠伤寒沙门氏菌TA102或大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA(pKM101 )6.2生物学特性的鉴定新获得或长期保存的菌种，试验前应进行菌株的生物特性鉴定。 菌株鉴定的判断标准如表1所示。表1试验菌株鉴定的判断标准菌株组氨酸缺陷色氨酸缺陷脂多糖屏障缺损氨苄青霉素耐药性切除缺损进行修复四环素抗性自愿变化蚁群的参考数*Ames研究所Zeiger研究所TA97战斗机/-是90至180 *75至200 *TA97a公司/-是90至180 *75至200 *TA98战斗机/-是30502050TA100/-是10020075200TA102/-是240至320 *100至400 *TA1535/-是-是1035520TA1537/-是-是315520WP2uvrA/-是-是/520WP2uvrA(pKM101 )/-是/100200注表明组氨酸是必要的表示需要色氨酸“”表示具有rfa突变表示具有r因子表明对鼠伤寒沙门氏菌具有uvrB变异对大肠杆菌有uvrA变异“”表示具有pAQ1质粒*体外代谢活化条件下自发转菌落数稍微增加一点。对于各菌的自发恢复范围，各实验室应参考其他实验室的数据建立自己的历史对照数据库，形成适合本实验室条件的适用范围。 同时，实验室的背景数据应与文献报道一致。6.2.1组氨酸缺陷/色氨酸缺陷原理组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基中生长，但在组氨酸不足的培养基中不能生长。色氨酸缺陷试验菌株本身不能合成色氨酸，只能在补充色氨酸的培养基中生长，但在缺乏色氨酸的培养基中不能生长。鉴定方法：将检测菌株的增菌液分别划分为含组氨酸或色氨酸的培养基平板和不含组氨酸或色氨酸的平板，在37培养24小时，观察结果。结果组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸的平板上生长，在不含组氨酸的平板上不能生长的色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸的平板上生长，但在不含色氨酸的平板上不能生长。6.2.2脂多糖屏障缺损原理：具有深粗糙度(rfa )的菌株表面缺乏脂肪多糖屏障，结晶紫穿过菌膜侵入菌体，抑制其生长，野生型菌株不受其影响。鉴定方法：将待测菌株的增菌液0.1mL吸入营养琼脂平板上，使湿润的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。 观察在37培养24小时的结果。结果：测定对象菌在滤纸条与划线交叉处出现透明菌带时，发现该测定对象菌具有rfa变异。6.2.3氨苄青霉素耐药性原理：含r因子的试验菌株对氨苄青霉素耐药。 由于r因子不太稳定，容易失去，用氨苄青霉素确认有无质粒。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，划入氨苄青霉素平板，37培养24，观察结果。结果判断如果检测菌生长在氨苄青霉素平板上，该检测菌具有抵抗氨苄青霉素的作用，表明其含有r因子，否则表明检测菌不含r因子或者r因子丢失。6.2.4紫外线敏感性原理：具有uvrB/A变异的菌株对紫外线敏感，紫外线照射下不能生长，但具有野生型切除修复酶的菌株能够如常生长。鉴定方法：将测定对象菌株的增菌液0.1mL吸入营养琼脂平板上，用黑纸复盖平板的一半，放置紫外线灯(15W，距离33cm)8 )照射8秒钟。 在37孵育24小时后，观察结果。结果表明：具有uvrB/A变异的菌株对紫外线敏感，受辐射照射细菌不生长，但具有完全切除修复系统的菌株能够正常生长。6.2.5四环素抗性原理：具有pAQI的菌株对四环素具有抗性。鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1mL吸入氨苄青霉素/四环素平板上，37孵育24小时后观察结果。结果：如果检测菌在氨苄青霉素/四环素平板上正常生长，则表明该检测菌株对氨苄青霉素和四环素均具有抵抗性，具有pAQI质粒，否则表明该检测菌株不含pAQI质粒。6.2.6自愿恢复原理：各试验菌株以一定频率自发发生回变，称为自发回变。 这种自发变化是各试验菌株的特性。检定方法：将测定对象菌株的增菌液0.1mL加入含组氨酸-色氨