免疫细胞化学染色技术在胸腹水诊断中的应用(吉林医学定稿)

免疫细胞化学染色技术在胸腹水诊断中的应用宋东明 朱安峰 （长春市中心医院病理科，吉林长春，130051）【摘要】 目的 通过借助于抗原抗体的特异性结合，达到识别组织和细胞中某些化学成分的目的，并明确其在细胞内的定位。方法 统计2011年全年间门诊、病房已出现胸腹水症状的患者经过脱落细胞学免疫化学染色技术方法处理标本。结果 采用半定量法以确定免疫反应的强度，阳性细胞数目及确定抗原存在的部位。结论 免疫细胞化学已经成为细胞学诊断最常使用的特殊诊断手段。【关键词】免疫细胞化学；细胞学；抗原修复技术细胞学诊断主要依赖于细胞涂片常规染色检查，取决于其形态学的基本特点。但经常会遇到一些诊断困难病例，对于细胞工作者一个极大的挑战是间皮细胞、组织细胞与癌细胞，特别是腺癌细胞的鉴别诊断，也就是胸腹水中良性间皮细胞与转移癌的诊断问题。此时辅助诊断方法或特殊诊断技术则十分重要。近代研究证实，免疫细胞化学（Immunocytochemistry）已经成为最常使用的特殊诊断手段。该方法是借助于抗原抗体的特异性结合，达到识别组织和细胞中某些化学成分的目的，并能明确其在细胞内的定位。通常将抗体做酶标记以显示颜色，即酶标技术。目前已有多种商品化的单克隆及多克隆抗体，可用于肿瘤来源的鉴别诊断，常常能给诊断以很大帮助。1 材料与方法1.1细胞涂片制备 本文所检查的对象系我院2011年1年间门诊、病房的出现胸腹水症状的患者，由临床医师在直视或B超、X线、CT引导下进行穿刺抽取浆膜腔积液，每人送检1-2次，经高速（15002000r/min）离心10分钟后，撇去上清液，收集沉渣，涂抹法每次制备3张涂片，待涂片潮干时，95%酒精固定1530分钟，最长不超过3天，经苏木素、伊红（HE）染色，中性树胶封片后，进行光学显微镜下观察。阅片后登记在册，阳性标本归档保存，以备复查比较。1.2免疫化学染色技术方法1.2.1涂片：各种细胞涂片、印片、微量细胞离心涂片及细胞组织微小组织片等均要求均匀，平薄，并保证足够的细胞数。为防止细胞脱落，玻片一定要洗净，最好涂抹多聚赖氨酸。1.2.2固定：适当的固定才能保持细胞的形态特点及抗原性。最常使用的固定液是酒精，酒精能完好地保存胞浆内抗原，包括中间微丝、肽类物质、激素等，但是许多表面抗原则容易丧失。在空气中已经干燥的涂片或微量离心涂片，为检查表面标记物，可以用甲醛丙酮(1：1)或福尔马林丙酮(1：1)缓冲液(PH值7.4)固定。一般要求保证固定10-15min即可。1.2.3免疫细胞化学染色程序：目前本实验室采用PV-9000通用型检测试剂盒，染色过程如下。(1)PBS洗3次，每次3-5min。如需采用抗原修复，可在此步后进行。（目前主要应用微波技术进行抗原修复，频率为2.45GHz，功率30600W任意调整，注意温度控制在4060。）(2)3%H2O2室温孵育5-10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗3次，每次2 min。(3)滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液， 4冰箱内过夜。PBS洗3次，每次2min。(4) 滴加试剂1（polymer helper）， 37孵育20 min，PBS洗3次，每次2min。(5) 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG）， 37孵育20-30min，PBS洗3次，每次2min。(6) 滴加DAB显色液，视显色强度决定显色时间(通常需5-30min)。显色液需现用现配，并严格控制配比浓度。(7) 自来水充分冲洗，苏木素复染细胞核1-3min。盐酸酒精分化，氢氧化氨返蓝，酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。并备有可靠的阳性及阴性对照。1.3 结果判断 1.3.1目前本实验室习惯采用半定量法1（染色强度指数计算法）代替，其公式简介如下：S（A0）（B1）（C2）（D3）S为染色强度指数；A、B、C、D分别代表-、+、+、+各种染色强度细胞数的%；S的范围是03。“3”代表100%的肿瘤细胞的染色均为D（强阳性），而“0”则代表100%的肿瘤细胞染色均为A（阴性）。1.3.2标记结果的正确判断任何一种免疫细胞化学染色结果，都必须以常规染色光镜形态为基础。必须掌握病变区的细胞形态特点，即选定好免疫细胞化学标记的靶细胞；镜下必须能识别出仍有阳性的内源性酶细胞，防止误认为阳性细胞；多数抗原在组织细胞中的分布是不规则性的，阳性细胞的数量不等，着色深浅不一，呈不均一性；阳性细胞的标准，PAB显色为棕黄色颗粒，背景清亮无着色，使用不同的抗体，阳性颗粒，可分布于不同部位，如淋巴细胞亚型分布于细胞膜，PCNA、P53、ER、PR等分布在细胞核，CK、EMA、CEA、S-100等则分布于细胞浆，细胞核结构清晰，边界清楚；全片染成黄色或深黄色，即使病变着色较深，仍为阴性，不可视为阳性，有时染胞浆的抗体，结果仅为核呈棕黄色而胞浆阴性，此时亦应当判定为阴性。1.4 统计学处理 采用SPSS 12.0 统计分析软件，进行t检验与X2检验，P 0.05 有统计学意义2 结果免疫细胞化学染色诊断恶性肿瘤阳性率为65.31%，HE常规染色诊断恶性肿瘤阳性率为22.45%,免疫细胞化学染色与HE常规染色检查结果比较具有明显差异（P0.001）。表1：2011年286例次胸水脱落细胞学检查结果年龄组性别阴性鳞癌腺癌肉瘤轻中度核异质重度核异质可疑癌合计男女204442130201028230314017203737415024829213251601913291113261703928611326771523275224184合计175111263040775286%61.1938.8191.9601.3902.452.451.75100表2：2011年302例次腹水脱落细胞学检查结果年龄组性别阴性恶性肿瘤未定型腺癌肉瘤轻中度核异质重度核异质可疑癌合计男女204377213021113133140211938114041504327682172605160322853412606170353355154368713416382233250合计169137260250131610306%55.2344.7784.970.651.6304.255.233.27100表3：免疫细胞化学染色与HE常规染色检查结果比较恶性肿瘤细胞（+）恶性肿瘤细胞（-）X2检验P值实验组:免疫细胞化学染色3217X2=22.05P0.001对照组:HE常规染色11383 讨论浆膜腔积液（尤其胸、腹水）是常见的临床体征,随着恶性肿瘤发病率的升高, 恶性浆膜腔积液不断增多, 在老年性积液中高达70%左右。细胞学检查一直是恶性浆膜腔积液的主要诊断手段, 但其敏感性低、经验性强, 难以满足临床需要2。因此, 恶性积液诊断及其与良性积液的鉴别常困扰临床医务人员。近年来, 通过体腔积液脱落细胞免疫化学染色辅助细胞学诊断倍受关注3, 人们试图通过检测肿瘤相关蛋白的表达, 为恶性细胞的诊断提供帮助。胸腔积液恶性细胞主要有以下几种4：（1）未分化的恶性细胞；（2）已分化的腺癌细胞；（3）已分化的鳞状细胞癌细胞；（4）淋巴系统的恶性肿瘤细胞；（5）恶性间皮瘤细胞。除（5）为胸膜的原发性恶性肿瘤细胞外，其余均为转移性肿瘤细胞。同样腹腔积液恶性细胞主要有以下几种：（1）未分化的恶性细胞；（2）已分化的腺癌细胞；（3）已分化的鳞状细胞癌细胞。原发于腹膜的恶性间皮瘤非常罕见，故以上均为转移性肿瘤细胞。3.1常见假阳性及假阴性的原因（一）假阳性1、所用抗体与其他无关抗原交叉反应，特异性差。特别是应用多克隆抗体血清时，更容易出现假阳性。2、所用抗体浓度过高，或组织细胞干燥，非特异性染色。3、组织细胞中含有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素等，产生非特异性显色。4、肿瘤组织或涂片中含有正常组织成分，误认为肿瘤细胞阳性。（二）假阴性1、所用抗体失活或浓度过低。2、标本处理不当，组织细胞自溶，抗原溶解以致消失，固定时间过长抗原漏出，或其他操作技术上的失误，均可造成假阴性。3、组织细胞中抗原含量低，直接法为阴性时，间接法可能阳性。3.2提高免疫细胞化学可靠性的措施1、选择的阴性及阳性对照：每次操作都应设有对照，这十分重要，否则无法判断其结果的可靠性。如选用某种抗体实验时，需同时选用已知阳性、已知阴性涂片各1张，同时操作全过程。只有当对照结果正确时，才表明实验全过程正确无误。根据国内实际情况，每张涂片设双重对照，在实际工作中存在困难。有人采取每批实验至少1张阳性对照，或采用同片对照，即在实验片内找到阳性或阴性细胞成分，对判断的可靠性也大有帮助。2、双重互补法及反证法的应用：免疫组化经常用于对未分化的肿瘤，确定其来源及原发部位。只根据某一种抗体染色阳性即确定某种肿瘤经常导致错误。正确的方法应当是以涂片常规染色为基础，选择一组，至少两种互相支持的抗体，同时再选用反面否定的抗体。这样将同时获得双重互补的、正反两方面的证实。这样才能真正地发挥免疫细胞化学的作用。3.3肿瘤特异性相关抗原尽管免疫细胞化学对于肿瘤细胞的来源，有时间接地用来判断肿瘤的良恶性，起到了一定作用。但是，对于肿瘤细胞特异性抗原的研究，虽经多年努力，仍是非常令人失望的。到目前为止，仍未发现绝对特殊的肿瘤抗原的报告。CEA（癌胚抗原）的发现，做为结肠癌的特异性抗原，曾给人带来过一线希望，但后来发现许多癌细胞，甚至有的良性细胞也呈现阳性反应。应用较成功的是AFP（甲胎蛋白），此抗体已应用多年，对肝细胞癌呈特殊反应，对良性肝细胞及高分化的肝细胞肿瘤均为阴性。胸腹水中的恶性细胞，最常见的是腺癌。此时CEA阳性，无论良性或恶性间皮细胞CEA均不表达。另一种抗体是Leu M1，大多数肿瘤可呈阳性，特别是腺癌，但在间皮细胞则肯定为阴性。如果CEA、Leu M1、两种均阳性，即基本上可以为腺癌，而不是间皮细胞。当然不能提供此腺癌的原发部位。CK和EMA在腺癌也呈阳性表达，但间皮细胞亦可呈阳性。Vimentin在间皮细胞通常为阳性反应，虽然有人提出，少数腺癌也会出现阳性反应，但对两者的鉴别诊断经常是有帮助的。根据肿瘤特定部位，可选用适当抗体。如疑为前列腺癌可用PSA，疑为甲状腺癌可用Tg，疑为神经内分泌肿瘤可用Cg-A，疑为乳腺癌可试用CA72-4。胸腹水中经常存在大量淋巴细胞，需要与恶性淋巴瘤及白血病鉴别。此时利用CD系统中的多种抗体，常可帮助鉴别良性与恶性，或属于何种表型。必须强调指出，胸腹水标本应用细胞化学反应时，常常会出现一些导致诊断错误的假阳性。其中包括：在细胞涂片或细胞的边缘部常出现弱的假阳性；也可在液体中出现弥散的抗原表达；坏死变性的细胞可出现假阳性；有时抗原为吞噬细胞或间皮细胞吸收也呈假阳性反应。再值得注意细胞本身的色素切勿误诊为阳性表达，如含铁血黄素、黑色素等。【参考文献】1Masunaga R， Kohno H，Dhar DK,，et al. Cyclooxygenase-2 expression correlates with tumor neovascularization and prognosis in human colorectal carcinoma patients. Clin Cancer Res 2000，6：4046-4068.2 Motherby H, Nadjari B, Friegel P, Kohaus J, Ramp U, Bocking A. Diagnostic accuracy of effusion cytology. Diagn Cytopathol 1999; 20: 350-3573 Pol