本科学生综合性实验报告

本科学生综合性实验报告姓名 陈春梅 学号 学院 生命科学学院 专业、班级 生物科学13级B班 实验课程名称 植物生理学 教师及职称 李忠光 开课学期 2015 至 2015 学年 第二 学期云南师范大学教务处编印实 验 室睿智三栋实 验 时 间周三下午7-8节实 验 名 称1、 光合色素的提取、理化性质2、 分离、吸收光谱及含量的测定3、 光合色素含量的测定1、实验目的1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。2、实验仪器及试剂材料：小桐子叶片、植物叶片3、实验原理（1）、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。（2）、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。 不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。 叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。 （3）、混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程 Ca = 12.7 A663 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645由于k是一个常数，而A可以通过 A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2 分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。k比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。故其单位为：摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为：4、实验方法、步骤及现象 （1）、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。方法及步骤 光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。 光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。 皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。 取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。 （2）、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 光合色素分离： 剪取适当长度和宽度的滤纸条 用上行纸层析法分离色素 启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。吸收光谱的测定： 光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。 各色素的吸收光谱：上述层析出的34种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。 （3）、方法一：快速测定法 由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2 方法二: 分光光度计法色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知的叶圆片0.05g左右，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心10min, 记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1 0.8之间。结果与讨论 1、认真记录观察到的结果（颜色变化？分几层？为什么？），并加以讨论。 思考题 1、为什么在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？结果与讨论 1、画出你的层析结果，并加以分析。 2、总光合色素和各光合色素的吸收光谱有何不同，为什么？思考题 1、光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？2、试论述高等植物光合色素的种类和生理功能结果与讨论Chl content = (mg.g-1FW) 1、根据原理中计算出三类色素的浓度（mg / L）。2式 分别计算出各种植物叶片色素含量。思考题 1、一般正常的植物叶片，Chla / Chlb = 3 / 1，