凤兼复合型太白酒发酵过程中酒醅微生物区系研究-文章

通讯作者简介:庄名扬（1940-），男，研究员，从事药物化学及酿酒微生物研究工作多年，获国内贸易部、四川省、成都市多项科技进步奖，出版低度浓香大曲酒生产技术专著，发表学术论文60余篇。第一作者简介：杨涛（1972），女，硕士，高级工程师，主要从事功能微生物选育及活性代谢产物研究。 凤兼复合型太白酒发酵过程中微生物区系研究II.糟醅微生物区系杨涛1，胡建祥2，吴林蔚1，蔡官林2，庄名扬*1，徐炜2 (1.中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041；2.陕西省太白酒业有限责任公司，陕西 眉县 722300)摘要：以太白酒正常生产窖池为试验窖，研究了凤兼复合型太白酒发酵过程中糟醅微生物区系的多样性、构成及及演替规律，并通过形态、生理学特性的分析比较以及16SrRNA基因序列分析，对发酵过程中主要微生物类群进行了分类鉴定。关键词：凤兼复合型太白酒；糟醅；微生物区系 Study on Microflora during the Fermentation Production process of Chinese Feng & composite type-combined-flavor of Taibai LiquorII. Microbial Communities in Fermentation grainsYANG Tao1, HU Jian-xiang2, WU Lin-wei1,CAI Guan-lin2, ZHUANG Ming-yang1，XU Wei2(1. Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences, Chengdu ,Sichuan2.Taibai Liquor CoLtd，Meixian，Shaanxi)Abstract：Taibai Liquor of Feng & Composite- Flavor pit of normal production for the test , we examined the species diversity 、constitution and dynamic changes of microbial communities in fermentation grains . In this research, we identified the main microbes of microbial communities in progresses on fermentation grains by using morphological and biochemical physiological identification 、16SrRNA clone analysis etc., modern molecular biology methods.key words: Chinese Feng & composite type-combined-flavor Taibai Liquor , fermentation grains, microbial communities引言中国白酒的发酵过程实际上是各类微生物的代谢消长过程，不同的地域、气候、环境条件及生产工艺，形成了不同的微生物群系及不同的微生物代谢变化规律，从而形成了不同的白酒风格。凤兼复合型太白酒是陕西太白酒厂在继承和发扬传统凤香型太白酒生产工艺基础上开发的新产品，采用秦岭主峰太白山的雪融之水作酿浆，选用优质高粱、大米、糯米、小麦为原料，大麦、豌豆、小麦进行中高温制曲，采用泥窖固态续渣发酵、老六甑混蒸混烧工艺，有别于传统凤型白酒和浓香型白酒的工艺和质量特征，口味特别而自成一格。为了进一步了解和掌握太白酒酿造过程中各类微生物的演变规律，深入探讨微生物代谢机理与产品质量和风格之间的关系，以利于更好地指导生产，我们采用微生物传统分离鉴定和现代分子生物学方法，对凤兼复合型太白酒的大曲、糟醅及酿酒环境的微生物区系进行了详尽的剖析。本文报导糟醅微生物区系的研究结果。 1 材料与方法1.1 试验糟醅取自凤兼复合型太白酒正常生产用窖池，发酵中分别按入窖3d、7d、10d、17d、24d（出窖）取样，均采集中上层样，采集深度为窖顶以下90-120cm。1.2培养基1.2.1 分离、计数培养基营养肉汁琼脂（细菌）；PYG培养基、酸性麦芽汁琼脂（酵母菌）；马丁-孟加拉红培养基（霉菌）。1.2.2 斜面培养基营养肉汁琼脂（细菌）；高氏合成一号琼脂（放线菌）；麦芽汁琼脂（酵母菌）；PDA培养基（霉菌）1.3 试验方法1.3.1 微生物分离培养及计数平皿稀释法1。细菌37培养48h，酵母菌28培养72h，霉菌30培养120h，芽孢杆菌分离时样品先80水浴10分钟，兼性厌氧菌的培养采用抽真空的方式，真空度0.08Mpa2。培养后计数并挑取单菌落，反复划线，纯化后挑于斜面培养基保藏备用。1.3.2 菌种鉴定细菌采用16SrRNA基因序列分析方法3；酵母菌采用形态观察和生理特性试验相结合的方法4,5；霉菌采用传统丝状真菌鉴定方法，以培养特征和显微形态为主要依据 4,6。2 结果与分析2.1 发酵过程中微生物数量变化（表1）表1 发酵过程中微生物动态变化（个/g糟）发酵时间（天）好氧细菌(个)芽孢杆菌（个）兼性厌氧菌（个）酵母菌（个）霉菌（个）入窖1.41053.81041.11032.510480035.31051.21053.41031.610533075.61051.41054.81032.1105260106.41053.11056.41031.6105187174.01056.61047.91038.2104172246.41044.81039.51024.51041632.1.1 细菌的数量变化好氧细菌的数量从入窖到发酵3d即迅速增加，达到105个/g糟，以后缓慢增加，10d以后开始下降。出现上述趋势的原因可能是刚入窖时糟醅中氧气和营养成分都比较充足，适于好氧菌的增殖，随着发酵进间延长，氧气减少，二氧化碳增加，酸度增加，均抑制了好氧细菌的生长。芽孢杆菌数量的变化趋势基本与好氧细菌一致，也在发酵3d即迅速增加，不同的是在发酵7d-10d之间又出现一个迅速增加的过程，可能是一些产酸和产香的芽孢杆菌快速繁殖，为中后期窖池发酵进入增香期奠定基础。兼性厌氧细菌的数量从入窖开始逐渐增加，发酵17d后减少。2.1.2 酵母菌的数量变化酵母菌的数量在发酵初期即迅速增加，入窖3d即达到105个/g糟，以后缓慢增加，7d后开始下降。出现此种变化趋势是因为刚入窖时氧气和还原糖含量高，利于酵母菌增殖，随着发酵进程的增加，酵母菌由菌体增殖转向酒精发酵，氧气减少，二氧化碳和酸度增加，酵母菌的数量逐渐减少。 2.1.3 霉菌的数量变化 霉菌主要来源于曲药和空气，好氧，在整个发酵期其数量均在缓慢下降，这与文献报道的其它香型白酒发酵过程中霉菌的变化趋势有所不同7-9。2.2 糟醅中微生物种类及优势菌分布测定了发酵前期(3天)、中期(10天)、后期(24天)糟醅中微生物的种类及优势菌数量变化。2.2.1 细菌糟醅中的细菌经分离纯化，得到22株不同的细菌菌株，其中的16株经16S rRNA基因序列分析(另外6株正在测定中)，分属于芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、棒杆菌属、微球菌属、假单孢菌属、节杆菌属、醋酸杆菌属等微生物分类属，以芽孢杆菌属菌株居多（表2）。这与张兴群10等人报导的西凤酒窖内细菌种群存在共性，二者的芽孢杆菌、乳杆菌和醋杆菌数量均较多，但二者也存在一定的差异，西凤酒中微球菌属菌株较多，而太白酒中微球菌相对较少，西凤酒中大量存在的黄杆菌在太白酒中未分离到，而太白酒中大量存在的解淀粉芽孢杆菌在西凤酒中未见报导。发酵前期和中期，芽孢杆菌数量较多，尤其是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，均达到了104个/g糟，这些菌株能产生淀粉酶、蛋白水解酶，将大分子物质淀粉、蛋白质水解为葡萄糖、氨基酸，氨基酸在脱氨、脱羧酶的作用下转化为丙醇、丁醇、戊醇、酪醇等醇类物质及其衍生物，使酒体醇香浓郁。葡萄糖、氨基酸在高温及长期发酵过程中必将发生非酶促褐变反应而生成杂环类化合物及其衍生物，使酒体放香具有芝麻香或酱香，口感绵柔、细腻。梭状芽孢杆菌(一些产己酸和丁酸的菌株均属于梭状芽孢杆菌)的数量相对较少，与乔宗伟等人报导的浓香型糟醅差异很大7，乳酸杆菌属和醋杆菌数量相对较多，这些菌株在发酵过程中可产生醋酸、乳酸、丁酸、己酸等有机酸，在酯化合成酶作用下生成相应酯。由于醋酸菌、乳酸菌占优势，乙酸乙酯、乳酸乙酯可能在含量上大于丁酸乙酯及己酸乙酯，使太白酒风格相近而不同于浓香型风格。表2 发酵过程细菌种类及优势菌数量（个/g糟）发酵时间(天)3（天）10(天)24(天)菌 名 数量（个）芽孢杆菌属地衣芽孢杆菌3.51048.71049.6102解淀粉芽孢杆菌1.11047.11048.1102枯草芽孢杆菌 2.11046.91048.2102短小芽孢杆菌2.31039.01031.8102蜡状芽孢杆菌8.71031.41042.9102巨大芽孢杆菌1.41043.01046.2102坚强芽孢杆菌7.51031.11043.7102延长芽孢杆菌9.01031.81042.9102Bacillus coahuilensis9.31031.91034.6102其他菌株金黄节杆菌8.91043.91042.8102施氏假单孢菌7.61045.21042.1102梭状芽孢杆菌属3.81035.21033.3103微球菌属2.91036.41031.3102棒杆菌属1.91035.81032.4102乳酸杆菌属2.91048.31042.1104醋杆菌属5.61048.11042.9104未鉴定菌株1.51055.81041.5104 2.2.2 酵母菌共分离纯化得到6株不同的酵母菌株，根据其形态特征和生理特性，初步鉴定为酿酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、异常汉逊酵母、白色球拟酵母和扣囊内孢霉，酿酒酵母、热带假丝酵母、异常汉逊酵母和扣囊内孢霉为主要的优势菌群。酵母菌的构成及优势菌群与施安辉、乔宗伟等人的结果有较大差异7,11。酿酒酵母主要作用为产酒，在整个发酵期数量均较多，为104个/g糟。扣囊内孢霉可发酵淀粉，发酵初期数量较多，发酵中期略有下降，发酵后期已降为103个/g糟。异常汉逊酵母、热带假丝酵母和产朊假丝酵母均为产酯、产香菌，异常汉逊酵母产乙酸乙酯能力强，整个发酵期的数量均较多，与酿酒酵母相近；热带假丝酵母产乙酯、产酒精能力较强，发酵前期和中期数量较多，发酵后期急剧减少；产朊假丝酵母数量在整个发酵期均较少；白色球拟酵母可产酒精和多元醇，是醇甜味来源菌种之一，在整个发酵期数量均低于其它酵母。表3 发酵过程酵母菌种类及优势菌数量（个/g糟）菌 名发酵时间(天)31024酿酒酵母2.81044.51042.5104产朊假丝酵母2.01047.51024.8102热带假丝酵母2.71043.11049.0102异常汉逊酵母2.71044.11041.8104白色球拟酵母1.01046.61021.9102扣囊内孢霉5.21043.61041.11032.2.3 霉菌共分离纯化得到9株不同的霉菌菌株，经培养特征和显微特征观察，分属于曲霉属、根霉属、毛霉属、红曲霉属、青霉属，以曲霉属菌株最多。霉菌的功能是产生各种生物酶，分解淀粉和蛋白质等大分子物质，主要来源于曲药和空气，入窖发酵后，数量急剧减少，发酵3天时，除米曲霉、阿姆斯特丹曲霉和根霉较多外，其他菌株均较少，在曲药中检测到的烟曲霉、犁头霉、杂色曲霉和文氏曲霉均未检测到，到发酵中后期，除米曲霉、阿姆斯特丹曲霉和红曲霉外，其它霉菌已检测不到。红曲霉因能耐酸、耐乙醇、耐高温，在发酵过程中数量不断增加，到发酵后期成为主要的霉菌，红曲霉能产生淀粉酶、蛋白酶及多种代谢产物，使制得的成品酒风味较好。表4 发酵过程霉菌种类及优势菌数量（个/g糟）菌 名发酵时间(天）31024曲霉属米曲霉1756747阿姆斯特丹曲霉1219066黑曲霉5无无其他霉菌根霉23无无毛霉1无无红曲霉33050青霉5无无3 结论太白酒厂特殊的地理环境、独特的生产工艺及特殊的曲药微生物区系，使太白酒发酵过程中糟醅微生物区系的构成及演替均呈现出与其它白酒不同的规律7-10。从微生物区系而言，以凤型酒酿造生物学特性为主，但梭状芽孢杆菌属等窖泥微生物的存在赋予了太白酒浓香特性，而大量芽孢杆菌的存在亦显示了酱香或芝麻香个性，从而造就了凤兼复合型太白酒“醇香馥郁，醇厚丰满，绵柔甜爽，诸味谐调，余味舒畅”的独特风格。参考文献：1 陈声明，张立钦.微生物学研究技术M.北京：科学出版社，20062 乔宗伟，张文学.浓香型白酒糟醅微生物分离培养基的选择研究J.酿酒科技，2004，(6)：30-323 Lane DJ, Pace B, Olsen GJ, et al. 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