利用重组酵母菌生产人类胰岛素--作业向-上传

利用重组酵母菌生产人类胰岛素某某人 114204XXXX摘要：利用PCR技术合成重组人胰岛素基因，并在A链和B链之间加入Kex2酶切位点。将合成的重组人胰岛素基因以正确的阅读框插入到组成型分泌表达载体pGAPZ-A的-factor信号肽序列的下游，构建成pGAPZ-A/Insulin重组分泌表达载体。表达载体用Bln I线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建成分泌型表达Insulin的工程菌。SDS2PAGE和Native2PAGE电泳说明A链跟B链是否正确地进行了切割并形成有高级结构的重组人胰岛素。WesternBlot结果表明：重组蛋白是否能够与鼠抗人Insulin抗体发生特异性反应而具有与天然Insulin相同的免疫原性。通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵培养基进行了筛选和优化；对高效表达人生长激素的培养条件进行了优化；根据优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵；对表达产物进行了初步鉴定。关键词：重组人胰岛素，毕赤酵母，分泌表达，培养基优化，晶体收集Use recombinant pasteris to produce human insulinName：UnknownAbstract：Use PCR synthesis of recombinant human insulin gene, join Kex2 cleavage sites between the A and B chains. The synthetic recombinant human insulin gene in the correct reading frame was inserted into the constitutive secretory expression vector pGAPZ-A -factor signal peptide sequence Preparation the construct pGAPZ-A/Insulin recombinant secretory expression vector. The expression vector linearization Bln I treated electroporation competent cells of Pichia pastoris GS115 constructed expression of secretory Insulin engineered bacteria.The analysis SDS2PAGE and Native2PAGE showed that A and B chains have already been cut correctly or not to form the recombinant human insulin with correct advanced structure or not.WesternBlot: The results show that the recombinant protein was able to specifically react with mouse anti-human Insulin Antibodies having the same natural Insulin immunogenicity or not. By single factor analysis and orthogonal experiment method of high density fermentation of Pichia pastoris medium screening and optimization; optimized culture conditions of the high-level expression of human growth hormone; according flask fermentation optimization results the fed-batch fermentation; preliminary identification of the expression product.Key words：recombinant human insulin, Pichia pastoris, secretion of expression, media optimization, crystal collection引言：利用重组酵母菌生产人类胰岛素在实验室中成功的案例已经被报道。通过分别构建重组人类胰岛素A链和B链的质粒来转染毕赤酵母的方法来获得分泌型表达人insulin的工程菌，并通过尿素-SDSPAGE电泳和Westernblot的方式来鉴定获得的重组蛋白是否形成正确的结构并具有生物学活性。并通过单因素分析和正交实验法对发酵培养进行筛选和优化并对表达产物进行了初步鉴定。实验器材、实验试剂：质粒和载体：pGAPZ-A表达载体、E.coli Topl0F、E.coli DH5、P.pastoris GSll5、pMD18-T EasyVector生化试剂：抗生素zeocin、TaqDNA聚合酶、10Taq buffer、限制性内切酶（Bln I、Xho I和Xba I）、T4连接酶、DNA回收试剂盒。一抗rat anti-human Insulin、二抗goat anti-rat IgG-HRP培养基：LB培养基，YPD培养基，BMGY培养基，酵母分批发酵培养基，酵母补料生长培养基，酵母诱导培养基，酵母鉴定培养基器材：分析天平、高压灭菌锅、恒温震荡培养箱、12.8L搅拌发酵罐、分光光度计、精密pH仪、高速冷冻离心机、生化培养箱、超级工作台、电泳仪、尾气分析仪、紫外检测仪、凝胶成像系统、中空纤维切向流系统实验步骤：设计引物合成insulin A链与B链: 根据In2sulin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏爱密码子，分3段合成Insulin基因：（1）Insulin基因片段1（Ins1）：5-tttgtgaaccagcatttgtg tggttctcat ctggtggaag ctttgtacct cgtgtgtggt gag-3;（2）Insulin基因片段2（Ins2）：5-ttgctccacgatacc tcttt ggtcttagg agtgtagaaa aaccctctct caccacacac gag-3; （3）Insulin基因片段3（Ins3）：5-gttacagtag ttttccagtt ggtagagaga acagatagag gtgcaacatt gctccacgat acc-3;（4）引物1（P1）：5-ta ctcgagaaaaga tttgtgaaccagcat ttgt-3；（5）引物2（P2）：5-gaggtgcaac attgctccac gatacc-3；（6）引物3（P3）：5-gc tctagact attagttacagtagttttcc agt-3；PCR连接Ins1和Ins2基因片段利用Ins1和Ins2部分互补及引物P1、P2进行PCR反应，PCR采用25l反应体系，10Taq buffer（含200mmol/L Tris-HCl pH8.4；200mmol/L KCl；100mmol/L （NH4）2SO4）15mmol/L MgCl2 2.5l，特异引物P1、P2和Insulin基因片段Ins1、Ins2（浓度为25mol/L）各0.5l，Taq酶1.25U，2.5mmol/L dNTP 2l，最后加ddH2O将体积调整为25l。在同一个PCR反应中，采用不同的退火温度，先使Ins1和Ins2退火延伸，再用P1和P2进行扩增，得到Ins1-Ins2片段。PCR程序如下：945min；94300s，4330s，7230s，10个循环；9430s，4730s，7230s，20个循环；72，7min；4 forever。使用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物。再次PCR：连接Ins1-2和Ins3基因片段利用Ins1-2和Ins3两个片段的互补及引物P1、P3，反应体系同1.2.1.2，采用不同的退火温度扩增得到Insulin全长。PCR程序如下：945min；9430s，3730s，7230s，10个循环；9430s，4730s，7230s，20个循环；727min；4 forever。PCR扩增结束后，在2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳并回收扩增产物，获Ins1-Ins2-Ins3即Insulin全长基因。PCR产物回收后与克隆载体pMD18-T Vector连接，用热激法转化感受态细胞E.coli DH5，筛选得到的阳性克隆送测序。表达载体pGAPZ-A/Insulin的构建：经测序鉴定后的质粒pMD18-T Vector/Insulin和组成型分泌表达载体pGAPZ-A分别用Xho I和Xba I双酶切，然后将双酶切后的Insulin基因与表达载体pGAPZ-A用T4 DNA连接酶在16连接过夜。产物用CaCl2法转化感受态细胞E.coli Topl0 F，转化子在含有25g/ml zeocin的低盐LB平板上初筛，并通过提质粒双酶切鉴定筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆送测序。工程菌GS115/pGAPZ-A/Insulin的构建及筛选：参照Pichia pastoris Expression Kit手册，表达载体pGAPZ-A/Insulin用Bln I线性化，然后用电转化法转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，转化参数为：电压1500V，电容25f，电击时间10ms。转化子在含有100g/ml zeocin的YPD平板上初筛，28培养23d长出单菌落，然后通过菌落PCR筛选阳性克隆。发酵及表达产物的SDS-PAGE分析：在转化平板上挑取单菌落于10ml YPD+Zeocin（100g/ml）培养基中，2830，250r/min振荡培养至OD600为26；吸取0.1ml菌液到50ml YPD+zeocin（100g/ml）培养基中，继续培养5d。收集菌液，4，12000r/min，离心10min，取上清；取1.5ml加入5倍体积的丙酮，-20放置过夜；4，12000r/min，离心10min，弃上清，风干；加入150l ddH2O溶解后作为SDS-PAGE分析样品。以Tricine-尿素-SDS-PAGE对发酵产物进行分析。发酵产物的浓缩及Native-PAGE分析：取10ml发酵液离心，600r/min，5min，去除沉淀下的细胞，取上清，并测量上清液的体积；缓慢加入（NH4）2SO4，使其浓度达到65%（0.43g/ml）；离心，12000r/min，15min，取上清；缓慢加入（NH4）2SO4。使其浓度达到95%（0.71g/ml）；离心，12000r/min，15min，取沉淀；将（NH4）2SO4沉淀后的蛋白利用透析袋进行透析。将透析后的发酵产物进行Native-PAGE分析。Westernblotting分析：取GS115、GS115/pGAPZ-A和工程菌的培养上清进行SDS-PAGE（以GAPDH为内参），然后将蛋白从凝胶中经电转移至硝酸纤维素膜上，先用1%的BSA封闭1h，用鼠抗人胰岛素抗体为一抗（抗体稀释比例为1300），山羊抗鼠IgG-HRP为二抗（抗体稀释比例为1250），显色后曝光以检测重组蛋白的抗原特异性。菌体培养摇瓶培养方法温度30，摇床转速230rmin，摇瓶装液量30mL300mL三角瓶。单因素实验设计分别以葡萄糖、甘油作为碳源，对比两者培养效果，利用SPSS软件对实验数据进行分析处理，选取培养效果好的作为碳源；分别以硫酸铵、酵母粉作为氮源，对比两者培养效果，选取效果好的作为氮源。然后对碳源的九个水平（10、15、20、25、30、35、40、45、50gL）、氮源的九个水平（4、6、8、10、12、14、16、18、20gL）、0.1molL磷酸盐缓冲液的九个水平(10、20、30、40、50、60、70、80、90mUL)、MgS0471-120的九个水平(8、9、10、11、12、13、14、15、16gL、初始pH值的九个水平(5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、6.9)等进行单因素分析，用单因素试验筛选出四个因素的三个最佳水平，作为正交试验的因素和水平。正交试验设计用L9（34）表安排四因素三水平实验，以甘油用量为A因素（水平为30gL，35gL，40gL），酵母粉用量为B因素(水平为l2gL，14gL，16gL），0.1molL磷酸盐缓冲液用量为C因素（水平为40mLL、50mLL、60mLL），MgS047H2O为D因素（水平为13gL，14gL，15gL）进行实验，共九个组合，每个组合设三次重复。分批补料发酵方法种子液制备从新鲜YPD平板上挑取单菌落，接入含BMGY培养基50mL300mL的摇瓶，30、230rmin下培养20h，作为一级种子。再以10的接种量接入BMGY培养基50mL（10瓶），同样条件下培养18h，至OD600为20左右，作为发酵罐种子液。分批补料发酵培养在12.8L全自动发酵罐中进行，发酵罐中装入改良BSM培养基6L，按8接种，培养过程中通气量不小于10Lmin，通过改变搅拌转速保持溶氧水平不低于30，用氨水调节pH至6.6。菌种生长初期DO较高，随着茵体的生长，耗氧量增加，DO不断下降。待DO降到30以下时，提高转速，当搅拌速率达到800rmin，解除溶氧搅拌关联。当DO陡然上升（表明甘油已经耗尽，耗时约16h），开始补加50甘油(含12mLLPTMl)，并控制流加速度维持DO在30-40，当发酵液的OD600至300左右时，开始加入甲醇（含12mLLPTMl）诱导，甲醇补加速率由低到高，甘油补加速率逐渐降低最后停止，该过度阶段约维持4-6h。根据溶氧的变化及尾气分析仪在线检测到的C02变化情况及时调整甲醇和氮源补加速率，适时放罐。表达产物分析发酵液置于低速冷冻离心机内以5000rmin恒温4C离心10min，取上清液于一80冻存备用。凝胶电泳（分离胶15，浓缩胶5SDSPAGE），以rhGH标准品为对照，电泳凝胶经凝胶成像系统扫描后由图像分析软件定量分析。SDS-PAGE凝胶电泳方法：按照参考文献配置分离胶和浓缩胶，先将分离胶注入长、短玻璃板间的缝隙内，以水封。待其聚合后倾去水，注入浓缩胶。轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，静置使凝胶聚合。在每个凹形加样槽内只加一种样品或分子量标记。向电极槽中倒入电极缓冲液，以50V恒压电泳至染料前沿迁移至胶板底边11.5cm处，停止电泳。取下胶板，用固定液固定过夜，染色2小时后脱色。凝胶电泳板脱色后，用凝胶成像系统进行分析可得到类rhGH的含量，再乘以总蛋白浓度即为rhGH浓度。总蛋白测定：Bradford法以Bio-rad的蛋白浓度测定试剂盒来测定所收集到的样品中总蛋白的浓度。菌体收集菌体收集单元操作是原核胞内表达蛋白，如重组人胰岛素生产的常规步骤。相比传统离心操作，中空纤维膜过滤技术具有处理速度快、寿命长、设备日常维护简单、可直接线性放大等特点，可以更好的满足重组胰岛素药物生产过程中数十吨级规模发酵液菌体收集对生产工艺重复性、工艺可放大性和经济性的要求。晶体收集多步层析精细纯化得到的胰岛素在冷冻干燥之前，常采用多次结晶和洗涤工艺进一步去除杂质、提高产品纯度。相比传统晶体沉降或离心收集工艺，中空纤维0.45微米滤膜可以有效截留胰岛素晶体，快速减小样品体积，从而实现高效的胰岛素晶体收集。此外，封闭的操作系统最大程度避免敞口操作，保证终产品质量安全。本研究采用中空纤维0.45m微滤膜进行重组胰岛素蛋白晶体快速收集，成功实现50 倍以上浓缩，显微镜观察显示所得晶型完好。预期结果PCR连接Insulin基因片段及克隆载体的构建回收套叠PCR产物（183bp Insulin基因片段），与载体pMD18-T vector连接构建成克隆载体pMD18-T-Insulin，转化大肠杆菌DH5后，通过PCR及双酶切验证阳性克隆，确定阳性克隆插入序列正确。分泌型表达载体pGAPZ-A-Insulin的构建用Xho I/Xba I双酶切pMD18-T-Insulin后回收Insulin基因，然后与同样经Xho I/Xba I双酶切回收的pGAPZ-A载体片段连接，构建成表达载体pGAPZ-A-Insulin，菌落PCR和双酶切鉴定以及测序分析以确定表达载体已构建成功。工程菌GS115/pGAPZ-A/Insulin的构建与筛选pGAPZ-A/Insulin表达载体经Bln I线性化后，利用电转化法转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化培养23d长出单菌落后，利用菌落PCR和SDS-PAGE筛选阳性克隆。不同培养时间对重组Insulin表达的影响分别分析工程菌摇瓶培养15d的培养基上清，先观察重组蛋白在24h时的表达量，然后随着培养时间的延长观察表达量的变化，可能表达量会升高，也有有可能在升高到一定程度后开始降解。综合考虑以上因素，确定在本实验条件下，工程菌目的蛋白可获得最高的表达所需要的培养时间。发酵产物的Native-PAGE电泳检测将发酵产物通过（NH4）2SO4盐析分级沉淀和透析袋透析后所获得的蛋白产物以human Insulin的标准蛋白为对照进行Native-PAGE电泳。通过电泳，可以检验不同培养时间下蛋白产物表达量的高低以及A、B链是否通过二硫键连接而未分开。Westernblotting分析工程菌培养上清能与鼠抗人Insulin抗体发生抗原抗体反应，呈现两条特异条带，而阴性对照GS115和GS115/pGAPZ-A在相应的位置没有特异条带。由此确定表达的蛋白确实是human Insulin。菌种发酵条件的选择通过单因素实验设计和正交试验设计方法确定最佳的碳源和氮源，pH等的最佳发酵条件，按照测得的条件进行发酵获得产物。产物收集使用选择的新型分离方法进行产物收集纯化，与传统收集方式进行比较。讨论、展望 在用巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）表达系统生产人胰岛素的过程中，常用的方法是在Pichiapastoris中表达猪胰岛素前体、胰岛素原、B1-29-A-A-K-A1-21，这样得到的猪胰岛素前体需要经过转肽操作，才能获得重组人胰岛素结晶，获得的胰岛素原和胰岛素原类似物在纯化后还需要通过酶切去除C肽，方能成为有功能的胰岛素，这样的做法比较复杂，而本方法在Insulin的氨基酸序列设计上除了在B链和-factor信号肽之间具有K