基因工程应用论文范文参考关于基因工程应用的优秀论文范文【10篇】

基因工程应用论文范文参考关于基因工程应用的优秀论文范文【10篇】 标记基因是一种用来筛选和鉴定转化细胞、组织和转基因植株的DN*段,包括起富集转化细胞作用的选择基因和易于检测表达产物的报告基因.抗生素类和抗除草剂类是当前转基因作物中采用的选择标记基因.目前常用的报告基因主要包括-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、-半乳糖苷酶基因(LacZ)、荧光素酶基因(Luc)、绿色荧光蛋白基因(gfp)和冠瘿碱合成酶基因等.植物转基因中最广泛应用的报告基因是gus.转基因作物进入商业化生产阶段,其外源基因的逃逸是不可避免的.因此使用安全的标记基因和报告基因是一个很好的选择.体外定向分子进化是发现和改造生物活性分子的重要方法,提供了一种高效获得多样性的方法.DNA改组是重要的体外分子进化技术,结合高通量筛选在农业、环境污染治理、化学工业、基因治疗、疫苗、蛋白药物等方面有着广泛的应用.近年来,许多体外分子进化的新策略和新方法层出不穷.DNA改组技术的发展和成熟是在上世纪九十年代末期.特别是进入21世纪以来,体外分子进化技术在新技术和新理论的推动下,又得到了长足的发展.推理设计是基于基因和蛋白质信息进行基因和蛋白质序列的改造,作为基因和蛋白质体外快速改造有其重要的一面.化学法合成DNA是生物学基础研究和生物工程应用的一个非常重要的手段,化学法合成基因提供了一种改造基因,阐明基因功能,分析蛋白质-核酸相互作用的强有力手段,通过化学法合成和改造后能够实现高表达,也是消除多个点突变的好方法.近年来化学法合成DNA的发展使得大规模合成较长DNA序列成为可能.随着化学合成寡核苷酸链广泛的用于各类引物、基因全合成、DNA芯片等领域,实现了合成寡核苷酸链的小型化,自动化及高通量化.诞生了一些界面友好的设计基因软件.基因全合成自从出现后一直就有着广泛的应用,近年来应用的范围也越来越广泛. 在重叠延伸PCR合成基因方法的基础上,建立了一种基于两步PCR的简单高效经济合成长DNA序列方法:PTDS.该方法主要涉及两步:首先通过12个长度60 nt且20 nt重叠的寡核苷酸,使用高保真的DNA聚合酶pfu合成4个长度为500 bp左右的的DN*段,其次通过第一步PCR产物作为模板,使用最外侧的引物和高保真DNA聚合酶pyrobest进行第二步的PCR扩增,从而合成完整的目的抗虫基因vip3aI.另外进一步通过改良的PCR精确合成方法(PAS)合成了一编码普鲁兰酶的pulA基因和一编码耐高温-葡萄糖苷酸酶的Tm-gus基因. 大肠杆菌的-葡萄糖苷酸酶基因,是一个使用广泛的报告基因.由于其具有检测灵敏,酶性质稳定,完善的酶学分析方法和可见的表型等特点,已经成为研究体外分子进化技术的一个好的模式.本文建立了一个高通量-葡萄糖苷酸酶基因的体外分子进化体系,并通过该高通量体系获得了一个较野生型显著耐受高温的突变体:GUS-TR.该突变体的大肠杆菌转化子在膜上能够耐受100的高温达30分钟,而对照不能耐受70的高温.通过6-His表达和镍离子螯合层析得到纯化的突变体和野生型蛋白GUS-TR和GUS-WT.酶活性测定结果显示,经过70处理10分钟,表达的野生型的GUS-WT活性明显下降,而表达的耐高温的GUS-TR,经过80加热10分钟处理活性依然保留88%左右,经过80度加热30分钟,活性依然保留在50%以上. gus-tr基因序列测定分析共有15个核苷酸位点发生改变,导致了12个氨基酸位点发生突变,分别是:I149T,N181S,D436E,V446A,A451V,Q493R,T509A,M532T,N550S,G559S,N566S和M591I.以gus-tr基因为模板进一步使用定点突变结合耐高温性状分析,发现存在于定点突变个体GUS-TR中的六个突变位点(Q493R,T509A,M532T,N550S,G559S和N566S)对于耐高温性的获得是重要的,且存在关联效应.其中Q493R和T509A位点是两个新发现的耐高温-葡萄糖苷酸酶关键位点.通过定点突变技术获得含有上述六个关键位点的突变个体GUS-TR3337.通过对突变个体GUS-TR3337和野生型大肠杆菌-葡萄糖苷酸酶(GUS-WT)的蛋白质纯化后分析,野生型蛋白质在70处理10分钟后酶活性完全丧失.而突变体GUS-TR3337在80处理10分钟后酶活性保留在75%以上.进一步通过蛋白质模型分析研究了耐高温突变个体和野生型之间的关系,从分子机制上探讨了-葡萄糖苷酸酶之结构和功能的关系. 为了直观地证明获得的耐高温-葡萄糖苷酸酶突变体在植物转基因中作为报告基因的可行性,将获得的突变基因gus-tr3337和大肠杆菌的野生型gus基因分别转入拟南芥植株中进行植物中耐高温性能研究.通过农杆菌蘸花法分别获得多个转基因株系,编号分别为YG8557(耐高温GUS基因gus-tr3337)和YG8555(野生型GUS基因gus-wt).通过对转基因YG8557拟南芥植株和YG8555拟南芥植株进行了高温处理后X-Gluc染色的实验发现,野生型GUS基因(gus-wt)转基因拟南芥未经高温处理显色良好,呈现蓝色.而经过60处理5分钟时略微显蓝色,且非常微弱,随着处理温度的升高和处理时间的延长,转基因植株均不能显蓝色.而耐高温改组GUS基因(gus-tr3337)转基因拟南芥植株未经高温处理显色良好,呈现蓝色.经过60处理20分钟、30分钟,70处理10分钟、20分钟、30分钟,80处理10分钟、20分钟很好的显蓝色.甚至80处理30分钟仍能够较明显的显示蓝色,说明经过体外定向分子进化技术改组突变的耐高温-葡萄糖苷酸酶(GUS-TR3337)在植物中依然能够保持耐高温性能. 通过RACE技术从苹果中克隆了一个编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因(mdepsps),多重序列比对分析发现苹果的EPSPS与蒺藜苜蓿的EPSPS关系最近.将mdepsps基因构建入原核表达载体pYPX251中,发现含有该表达质粒的大肠杆菌菌株不能够在含有30 mM的草甘膦的M9培养基正常生长.通过体外定向分子进化技术对mdepsps进行了改造,获得了在M9培养基上添加50 mM的草甘膦仍能正常生长的阳性克隆15个. 本文从果树基因工程研究中广泛使用的报告基因(-葡萄糖苷酸酶)和有潜在应用前景的选择标记基因(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)两方面入手,分别通过基因分离、设计、化学合成、体外定向分子进化等手段进行研究.通过化学合成和体外定向分子进化获得的耐高温的-葡萄糖苷酸酶可以作为新型报告基因在果树基因工程中应用,尤其是一些具有较高内源GUS的果树物种.从苹果中克隆并通过改组提高功能的编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因具有:苹果,安全可靠,功能良好等特点,且具有自主知识产权,有较强的理论和实际意义.上述研究丰富了果树基因工程中的报告基因种类,对果树遗传转化有一定的意义,同时也进一步丰富了果树基因工程中的基因,尤其是安全性的果树本身的基因,为果树基因工程应用奠定基础. 抗生素的滥用不仅导致了药物残留等公共卫生隐疾,而且由于耐药菌株的出现,使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题.一种全新抗菌药物的开发已经成为当代微生物学家、医药学家和兽医工作者的主攻课题.抗菌肽由于其广谱高效抗菌活性及独特的抗菌机制而在新型抗菌药物研究中显露明显优势. 抗菌肽(Antibacterial peptides,ABP)是生物体产生的一种阳离子小肽,多数具有广谱抗菌活性,是生物先天性免疫的重要组成成份.仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞.近20年来,人们对昆虫抗菌肽已进行了比较系统的理论和应用研究.但有关畜禽抗菌肽基因工程应用研究方面的报道较少.本研究的目的就是应用基因工程研制出具有自主知识产权的六种天蚕素类重组基因工程抗菌肽,以及作为一种添加剂对鸡肠道正常微生物菌群的影响.为重组抗菌肽的工业化生产奠定基础.研究主要从以下几个方面展开： 1选用毕赤酵母偏爱*子,通过SOE法合成抗菌肽Cecropin B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点.亚克隆Cecropin B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将cecropin B及其串联体克隆至表达载体pPICZ-A上,用SacI酶切使之线性化后,采用电击法转化酵母*D1168,转化子用小瓶发酵.经Tricine-SDS-PAGE检测,在信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,初步抑菌活性试验显示,二者对金*葡萄球菌和耐氨苄青霉素的大肠杆菌有较好的抑杀活性.从抑菌直径来看,串联体并不像预计的那样比单体的抑菌直径大3倍,单从表达量方面分析不足以说明3个单体都得到了表达,这可能与毕赤酵母的表达条件有关,也可能与Kex2酶切位点的酶切效果有关.其具体原因还有待于进一步的研究和探讨. 2根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA,CA)N端第1-7个氨基酸残基,马盖宁(magainin,M)N端第2-12个氨基酸残基,以毕赤酵母偏爱的*子设计合成了杂合肽CA(1-7)-M(2-12)基因,同载体pPICZ-A连接后转化Pichia pastoris受体菌*D1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1.9kD的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达,抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G-菌及G+菌均有较好的抑菌活性.在以上研究结果的基础上,参考相关天蚕素类抗菌肽的作用机制以及抗菌肽结构与功能关系的假说,设计了杂合肽cecA-mag的三个突变体并利用重组聚合酶链式反应定点诱变技术,使突变体得以合成,利用琼脂孔扩散法检测cecA-mag和其突变体对金*葡萄球菌的抑菌效价.试验结果显示,三个突变体的抑菌活性比cecA-mag分别提高了1.2、1.2、1.5倍. 3毕赤酵母*D1168菌株由于蛋白酶A和羧肽酶Y活性全部缺失,仅存部分蛋白酶B活性,该特性非常有利于发酵液中重组抗菌肽表达物的稳定,较之x-33、GS115两种酵母菌株,更适合表达抗菌肽之类的生物活性小肽,本实验选用*D1168毕赤酵母菌株表达cecropinB以及其串联体基因和cecA-mag的三个突变体基因抗菌肽.对上述六种重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了表达优化,结果表明重组酵母菌在BMGY培养基中增殖OD_(600)为56时转接BMMY培养基；BMMY培养基pH值为6.0,28培养60h；补加1.0甲醇；可提高重组抗菌肽的表达量和抗菌活性.抑菌试验,证明重组基因工程抗菌肽对G+和G-均具有良好的活性.酸碱稳定性实验结果显示,所表达的重组抗菌肽在pH等于3.5时仍然有很好的活性,热稳定性实验显示,重组抗菌肽100加热5min,仍有活性,基于这样的特性该抗菌肽有望在饲料和食品添加剂中得到很好的应用.重组抗菌肽的体外稳定性试验显示,所研制成功的六种基因工程抗菌肽在4到保存30天仍有良好的活性,从而提示4是其最佳的保存方式.目前为止,还没有对抗菌肽的单位有权威的最后报道,表达量的高低也不能简单的等同为活性的强弱,所以笔者认为浓度单位可能是恰当的用来衡量其活性的方式,所以对研制成功的六种基因工程抗菌肽单位应用MIC来初步表示.大肠杆菌的MIC的测定结果发现：cecA-mag、cecA-mag-mu-1、cecA-magmu-2、cecA-mag-mu-3、cecB、3,cecB对大肠杆菌的MIC分别为：0.92、0.73、0.75、0.69、0.5、0.41,M.在此基础上对合成的六种基因工程抗菌肽的抗菌谱进行了完善.对金*葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用通过其生长曲线有了系统的了解,通过曲线显示对金*葡萄球菌和大肠杆菌在cecB和cecA-mag在40g mL(-1)的使用剂量下上述两种细菌得到完全抑制！ 4以普通1日龄莱杭蛋雏鸡为研究对象,将120只雏鸡分为6个组,每组20只,其中不同剂量抗菌肽治疗组又分为口服和肌肉注射两个不同的处理,每个处理10只.研究了重组抗菌肽CecropinB治疗雏鸡大肠杆菌感染的效果.通过预试验,初步确定了选用的大肠杆菌对雏鸡的最小致死剂量(MLD_(100)为1,107个细菌.最小致死剂量(1,107个细菌mL)大肠杆菌肌肉注射24h后,肌肉注射和口服不同浓度的重组cecropinB抗菌肽,连续治疗5天.结果表明,重组抗菌肽cecropinB对大肠杆菌有较好的治疗效果.其中高剂量(0.75mL)的口服组的效果最佳,其治疗效果要优于市面上出售的兽用盐酸环丙沙星效果,治愈率达到80,中剂量(0.5mL)的口服组与高剂量肌肉注射组的治愈率相同为70.中剂量肌肉注射组与环丙沙星组效果一致,治愈率达到60,低剂量抗菌肽治疗组,治疗效果不如上述的所有治疗组,说明所研制的基因工程抗菌肽在治疗大肠杆菌感染时存在一定的剂量依赖关系.与感染对照组相比,所有组别的雏鸡死亡率显著降低,抗菌肽高、中、低剂量组的有效率、治愈率与环丙沙星组差异不显著. 5抗菌肽作为生物体先天性免疫的主要组成成份,在抵御外来病原侵袭中发挥着重要作用,特别是两栖类和昆虫类,缺乏高效精确的细胞免疫系统,所以抗菌肽就成了其免疫防御系统的关键成份.抗菌肽对细菌、真菌、病毒、原虫及癌变细胞都具有广泛的杀伤活性.将250羽健康蛋雏鸡随机分成5组,每组50羽,其中盐酸环丙沙星组为抗生素对照组,空白对照组不添加任何成份,合成的基因工程抗菌肽cecropinB高、中、低三个剂量以饮水混饮的方式饲喂,高中低剂量分别为2、4、8ml L(-1)对实验各组鸡的免疫器官指标以及体重增重进行了测试和分析,结果表明,所选用的抗菌肽高中低剂量组都不同程度的增强了鸡的平均日增重,不同剂量之间差异显著(P0.01),对雏鸡免疫功能的增强作用通过脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数三个指标得以体现,以高剂量组的增强作用最为明显.此外,对基因工程抗菌肽cecropinB对鸡巨噬细胞的吞噬能力进行了探讨.SPSS统计结果表明,高剂量组吞噬率与其它各组比较,差异显著(P0.05)；高剂量组吞噬指数与药物对照组比较,差异显著(P0.05),总体看来,实验组的吞噬率和吞噬指数高于对照组,尤其是高剂量组吞噬率和吞噬指数明显高于对照组,吞噬率和吞噬指数是巨噬细胞吞噬功能的具体表现,从而说明基因工程抗菌肽cecropinB可以提高鸡巨噬细胞的吞噬能力.这一研究结果为基因工程抗菌肽的进一步应用奠定了基础. 6动物肠道内栖息着复杂多样的微生物区系,该区系对宿主的生长、健康具有重要意义.为研究cecropinB对雏鸡肠道微生物区系的影响,试验将250只1日龄雏鸡随机分成五个处理组,每个处理组50只,试验组以混饮的方式饲喂不同浓度的cecropinB,对照组也以混饮的方式饲喂盐酸环丙沙星,空白对照组饮水中不添加任何成份.用量和饲喂方法同上.分别于42、49d取盲肠、回肠内容物进行PCR-DGGE,对肠道的几种优势菌的多样性进行了研究.分析结果表明,饲喂含cecropinB对雏鸡盲肠、回肠中微生物种群种类未产生明显的影响,各组鸡肠道中微生物种群类型既具有一定的相似性,又存在一定的差异.对回肠内容物16SrDNA进行克隆、测序显示,饲喂cecropinB的高剂量组比空白对照组多了一条与厌气弯杆菌同源性为78的条带,其具体原因和机理还有待于进一步的研究.试验结果显示,CecropinB作为一种饲料添加剂在试验期内对雏鸡肠道微生物区系没有产生明显的影响.这也是国内外首次基因工程抗菌肽对雏鸡正常微生物菌群影响的相关报道. 干旱和盐碱是影响植物生长发育最主要的非生物胁迫因子,许多重要的农作物如水稻、马铃薯、烟草等对干旱和盐碱比较敏感,缺乏有效的耐旱机理,经常因干旱和盐碱造成严重的产量损失.培育抗旱耐盐农作物新品种是利用干旱盐碱地最为经济、有效的措施.随着现代分子生物技术的飞速发展,通过基因工程技术改良农作物抗旱耐盐性工作取得了很大的进展.高等植物适应环境胁迫的重要生理机制之一是渗透调节,甜菜碱是其中最重要的渗透调节物质之一.而且它的合成途径简单,对细胞无毒害,具有稳定酶和细胞膜结构,清除过氧化物等非渗透保护功能,被认为是最有希望的渗透调节物质之一. 系统获得性抗性(Systematic acquired resistance,SAR)是植物抵御病原菌侵染的最有效手段,利用基因工程技术导入SAR信号发生过程中的关键基因后,植物的SAR基因表达量提高并且对病原菌侵染的反应速度加快,因此植物的抗病性得以增强,与传统的抗病基因工程技术相比它对病原菌没有专一性,许多学者称之为广谱抗病基因工程,该领域已成为目前抗病基因工程研究的热点和前沿. 绿原酸是金银花在生长发育过程中产生的重要次生代谢产物,近年来随着金银花研究的不断深入,绿原酸的含量、合成机制及有效地开发利用成为了生物化学、分子生物学以及代谢工程研究领域的一个热点.为了能有效地提高金银花绿原酸含量,本研究从基因克隆、基因结构与功能的生物信息学预测、基因表达等不同的方面对金银花绿原酸生物合成过程中重要的三个关键酶基因进行了相关研究,既为研究金银花绿原酸的生物合成机制奠定基础,也为基因工程在代谢工程的应用提供一定的借鉴.本论文的主要研究结果如下： （1）采用RT-PCR及RACE方法从金银花中分离到绿原酸合成紧密相关的LjHCT、LjC3H1及LjCCoAOMT1基因的全长CDS序列,LjHCT基因CDS全长1293,编码430个氨基酸,LjC3H1基因CDS全长1533,编码510个氨基酸,LjCCoAOMT1基因CDS全长744,编码267个氨基酸.通过对不同物种三个基因的亲缘关系分析,显示金银花LjHCT基因与桔梗与刺苞菜蓟HCT基因相似性最高,金银花LjC3H1基因与咖啡和红车轴草C3H1基因相似性最高,金银花LjCCoAOMT1基因与羊奶参和光皮桦的CCoAOMT1基因相似性较高,这三个基因与木本植物的相似性要高于草本植物.通过跨膜结构域的预测分析,LjC3H1蛋白有一个跨膜结构域,而其他两个蛋白没有跨膜结构域.通过亚细胞定位分析显示LjHCT蛋白可能在叶绿体或线粒体上发挥作用,LjC3H1蛋白可能在叶绿体上发挥作用,LjCCoAOMT1蛋白可能在细胞质中发挥作用.通过疏/亲水性分析结果显示,三个蛋白全为亲水性蛋白.二级结构分析显示三个蛋白都主要以螺旋与不规则盘绕为主.通过氨基酸保守序列分析显示LjHCT蛋白包含有转移酶的保守序列,LjC3H1蛋白包含有细胞色素P450的保守序列,LjCCoAOMT1蛋白包含有*转移酶的保守序列.并构建了三种蛋白的*结构模型. （3）利用大肠杆菌BL21对LjHCT,LjC3H1与LjCCoAOMT1基因所编码的蛋白进行了原核表达,并采用镍柱纯化的方法得到了三种可溶性重组蛋白,我们将融合蛋白用考马斯亮兰染色的方法,检测到Pcold-LjHCT融合蛋白大小约为92kDa,pCOLD-LjCCoAOMT1蛋白大小为72kDa,pCOLD-LjC3H1蛋白大小为102kDa.金银花开花期不同组织绿原酸含量与LjHCT, LjC3H1及LjCCoAOMT1基因表达量的相关关系研究表明,LjCCoAOMT1基因的表达与绿原酸含量有显著的相关性,而LjC3H1与LjHCT基因的表达与绿原酸含量的相关性没有达到显著水平.LjHCT与LjC3H1基因的表达呈一定负相关性,但没有达到显著水平,这可能与LjHCT催化p-香豆酰辅酶A变成p-香豆酰奎