Chapter6--植物胚胎培养和离体授粉

植物胚胎培养和离体授粉Embryocultureandinvitropollinationofplant,Chapter6,植物胚胎培养概念,指胚(成熟胚或未成熟胚)或具胚器官在离体无菌条件下进行培养，以获得发育正常的植株的技术。,Shapeofseed,Color,WeightandSizeVariationsinSeeds,Assortedbeans,wheatgrain,fenugreek,blackmustard,hemp,oats,Goldenflax,Pintobeans,coriander,Varietyofpulses,Structureofseed,种子的形态存有差异，但种子基本结构却是一致的。,有些种子成熟后胚乳消失，形成无胚乳种子。少数种类的种子还具有外胚乳（per-isperm）结构。,子叶,胚根,胚轴,胚芽,胚,Structureofseed,Structureofseed,胚乳(Endosperm)：有或无。胚乳种子中储藏营养物质的薄壁组织。依种子在成熟时是否具有胚乳，将种子分为两种类型：有胚乳种子（albuminousseed）无胚乳种子（exalbuminousseed）,Structureofseed,胚乳功能：贮藏营养物质。糖类淀粉，糖，半纤维素、油脂和蛋白质等。其中淀粉最为常见。,Structureofseed,种子的来源,(Originofplantseeds),双受精,进入胚囊中的两个精子，一个与卵细胞融合形成合子（受精卵），另一个与中央细胞融合形成初生胚乳核的过程，它是被子植物所特有的现象。,种子的来源,(Originofplantseeds),种子的结构,植物胚胎培养：指胚(成熟胚或未成熟胚)或具胚器官在离体无菌条件下进行培养，以获得发育正常的植株的技术。,植物胚培养根据在培养中所取外植体的部位不同可分为,胚培养(embryoculture)胚乳培养(endospermculture)胚珠培养(ovuleculture)子房培养(ovaryculture),无菌条件下将胚从胚珠（幼胚）或种子中（成熟胚）分离出来，置于培养基上进行离体培养获得再生植株的方法。,一、胚培养,胚龄越小，所需的营养物质就愈复杂，也愈难培养。,植物胚的发育过程,球形胚前期,心型胚前期,鱼雷胚,球形胚,手杖形胚期,成熟胚期,（一）成熟胚培养,成熟胚为子叶期以后的胚，其在简单的基本培养基上即可萌发生长。对培养条件和操作技术要求相对简单。主要适用于珍稀杂种的种子萌发及某些难繁殖植物的抢救等，可以克服由种皮或果皮等造成的发芽障碍，同时也可避免自然环境对种子萌发的不利影响。,牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony,（二）幼胚培养,对未发育成熟的胚进行培养。要求较好的培养条件和较复杂的操作技术（胚剥离）。,分离技术,营养条件,1、幼胚培养步骤,1）材料的选择与灭菌：适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚期。2）幼胚的分离分离操作技术的关键步骤：a，借助于解剖镜；b，注意保湿；c，动作迅速；d，带胚柄取出；e，立即接种。3）幼胚的接种培养,2、幼胚离体培养中常见的生长发育方式,胚性发育(embryonaldevelopment)幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。,早熟萌发(earlymaturesprouting)幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称为早熟萌发。,愈伤组织在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。,在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。,2、影响幼胚培养的因素,1）培养基A、基本培养基幼胚要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和生长辅助物质，不同发育时期的幼胚对培养基成份要求不同，胚龄越小培养及成份越复杂。K+、Ca2+水平稍高有利于幼胚培养。,B、蔗糖：糖的作用：调节渗透压；碳源；防止幼胚早萌。渗透压的保持对于幼胚培养相当重要，幼胚需要蔗糖浓度较高。最适蔗糖浓度随着胚的发育时期而降低。,胚发育早期要求较高的的渗透压，而随着胚的发育逐渐降低。,C、植物激素的作用：低浓度的GA能促进幼胚的早熟萌发。有时GA还具有胚柄的作用.低浓度生长素对幼胚生长有促进作用，高浓度则有抑制作用。,D、天然提取物及某些蛋白制品的作用银杏幼胚培养中添加银杏胚乳有促进作用（李继侗，1934）；曼佗罗幼胚培养中发现添加椰子乳能很好的促进幼胚的发育(200-500um的幼胚)（1941）。此外，大麦胚乳、麦芽提取物、酵母提取物、水解酪蛋白等都能促进幼胚的发育。,2）胚胎发育时期一般胚龄越小，越难培养；双子叶植物：心形胚期以后的胚较易培养禾谷类植物：梨形胚期（受精后8d左右，0.5mm以上）后较易培养,3）培养条件A、温度：多数为25-30，以该植物种子萌发的适宜温度为好。B、光照：大多数处于球形期至心形期的幼胚,需要在黑暗条件下培养两周后再给予光照,早期光照不利于胚根发育,但胚芽发育需要光照.C、pH：不同种类植物和不同发育时期的幼胚对pH的要求不同。,例：荠菜胚的培养过程,双子叶植物（球形胚晚期以及更大的荠菜胚）的培养：消过毒的荠菜蒴果放在几滴无菌培养基中用镊子将蒴果外壁的两半撑开，露出胚珠解剖镜下可见胚珠中绿色的鱼雷形或更幼龄胚由胎座上取下一个胚珠，放在凹玻片中（内有一滴培养基）用锋利的有柄刀片将胚珠纵切成两半留下有胚的一半，仔细剔除胚珠组织,取出连着胚柄的完整胚（较老胚在胚珠上无胚的一侧切一小口，用钝头解剖针轻压珠被）把完整的胚挤出到周围的液体中接种到培养基上暗培养幼胚发育到鱼雷形阶段转移到降低蔗糖浓度（23%）的同样培养基上光培养至发育成熟新的植株,3、植物胚胎培养的应用,远源杂交中克服杂种不育（胚胎拯救）杂种胚一般生活力低下，发育不良，通常不育，利用胚胎培养就能得到杂种后代，从而选育出优良品种促进无生活力或生活力低下的种子萌发长期营养繁殖的植物，种子可能无生活力或生活力低下，利用胚胎培养有可能促进这类种子萌发和形成幼苗缩短育种周期有些植物种子的休眠期很长，通过离体培养，可以使休眠期缩短或打破休眠理论研究利用胚胎培养方法，可以对整个胚及胚各个部分的再生潜力、影响胚胎发育的因素、器官发育过程、胚与胚乳的关系等相关问题展开研究单倍体产生：大麦球茎大麦，小麦玉米,二、胚珠和子房培养,（一）胚珠培养,1、材料的选择和灭菌：未授粉胚珠：开花前1-6天，授粉胚珠：授粉后1-120天不等，较晚时期有利于胚的发育。灭菌：先对子房或外表组织消毒灭菌后，后取出胚珠培养（可带胎座组织一起取出）。2、接种培养,（二）子房培养,1、子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。2、未授粉子房培养应注意的问题：材料的选择：开花前1-5天的花蕾，发育时期（接近成熟胚囊易于成功）；可部分保留花被。培养基：基本培养基（MS、N6、B5等）、植物激素（配合使用）、蔗糖浓度（3-10%）培养方式：直插优于平放。,（二）子房培养,3、子房培养物的倍性：二倍体：来源于合子（受精后）或体细胞三倍体：来源于胚乳（受精后）单倍体：来源于未受精的胚囊内的细胞（卵细胞、助细胞、反足细胞、极核细胞）,Wendeletal.2003,Genomedoublinghasledtoanarrayofmoleculargeneticinteractions,includinginter-locusconcertedevolution,differentialratesofgenomicevolution,inter-genomicgenetictransfer,andprobablealterationsingeneexpression.,Rappetal.2010,Muchofourcurrentunderstandingabouttheroleofphytohormonesinfibergrowthanddevelopmentcomesfromstudiesofisolatedovulesinculture.Fiberinitiationinunfertilizedovulesispromotedbytheadditionofauxinandgibberellicacid.,（三）未传粉子房和胚珠培养产生单倍体,诱导孤雌生殖，是产生单倍体的途径之一影响因素（P63）：供体植物的基因型子房的发育阶段：接近成熟期的胚囊较易诱导成功（单核至四核胚囊期）培养基成分：防止诱导产生愈伤组织培养条件：冷冻预处理或较高温度（35）预培养对产生单倍体往往有促进作用,1.蓼型胚囊的发育70%以上被子植物，如水稻、小麦、油菜等,大孢子母细胞,四分体（线形）,单孢子胚囊,成熟胚囊,珠孔端,合点端,回,三、植物胚乳培养,胚乳培养（Endospermculture）：是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。,（二）概述胚乳培养的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。胚乳培养的研究主要集中在以下一些问题的探讨：,胚乳细胞的全能性。在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。,大多数被子植物的胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养技术，探索改良农、林及园艺植物三倍体育种技术的可能性。,研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。,到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、叶等或得到愈伤组织。,影响胚乳培养的因素基因型胚乳的发育时期培养条件,A、胚乳发育时期的影响发育早期胚乳：操作不便，诱导率低游离核期或刚转入细胞期的核型胚乳：难获得愈伤旺盛生长期（细胞形成期）胚乳：易诱导产生callus成熟期胚乳：已高度分化，很难诱导脱分化,一、胚乳的发育（初生胚乳核胚乳）（一）核型胚乳：初生胚乳核核分裂多数游离核质分裂多细胞的胚乳（二）细胞型胚乳：初生胚乳核核分裂、质分裂多细胞的胚乳（三）沼生目型胚乳珠孔室(大)游离核胞质分裂多细胞初生胚乳核第一次分裂胚囊分成合点室(小)游离核,核多次分裂,旺盛期胚乳特征胚已分化完成胚乳已形成细胞组织充分生长，达到成熟大小外观为半透明的固体状富有弹性,水稻：授粉后4d黑麦草：授粉后8-10d黄瓜：授粉后7-16d梨：授粉后20d大麦：授粉后10-20d玉米和小麦：授粉后8-12d,一些草本植物胚乳培养的适宜取材时期,一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus诱导率很低，甚至无callus,B、培养基和激素的影响基本培养基：MS、B5、MT、White、LS等水解酪蛋白、酵母提取物也很必要激素：要求特殊大麦胚乳只有在添加2，4-D的培养基上才能生长猕猴桃胚乳培养中，玉米素最好枣的胚乳培养中，激素似乎无特殊要求,C、胚因子胚在萌发时产生某种物质影响胚乳的发育过程，这种胚对胚乳的影响，即称为“胚因子”影响。胚乳培养中，外源GA3能部分取代胚因子。,D、其他因素的影响蔗糖浓度：3%-5%温度：25pH值：如蓖麻5.0;玉米6.1-7.0；苹果6.0-6.2等,胚乳培养方法：A、取授粉4-8d后的幼果，常规消毒B、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳C、接种在培养基上，在25-27和黑暗条件或散射光下培养形成愈伤组织D、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下不定芽E、插入生根培养基中，光下培养10-15d，切口处长出白色的不定根,枸杞胚乳培养的过程,开花20d的枸杞胚乳MS+2，4-D0.2mg/L生根MS分化出苗MS+BA0.2mg/L不同倍性的胚乳植株,callus,胚乳培养的形态发生器官发生；愈伤组织形成。,胚乳培养植株要进行染色体倍性检测,（1）因为在胚乳培养中，由于愈伤组织的倍性比较复杂，有二倍体、三倍体等多种倍性以及非整倍体，真正的三倍体细胞所占的比例甚小。（2）诱导分化的胚乳植株中染色体数也不稳定，同一植株往往有可能是不同倍性的嵌合体。,再生植株的染色体倍数1、稳定型继代培养后染色体无变化，植株三倍体2、畸变型细胞染色体异常，植株为多倍体，且不一致，形成多种倍性细胞组成的嵌合体。,四、离体授粉,在无菌条件下，培养离体的未受精雌蕊或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉管进入胚珠，完成受精过程而获得有生活力种子的技术。,（一）离体授粉的基本技术过程,1、亲本的选择：父本（收集花粉）：套袋（时期）表面消毒（时期）花粉收集（时期）母本（选取雌蕊或胚珠）：套袋表面消毒去雄剥取雌蕊或胚珠不同植物最适时期不同，但必须是未受精状态2、离体授粉受精：父本（收集花粉）：,（二）影响离体授粉成功的因素,1、发育时期2、培养基成分3、培养温度4、材料消毒5、母体组织的保留6、授粉方式,（三）离体授粉技术在杂交育种上的应用,克服植物远源杂交不亲和性克服自交不亲和性诱导孤雌生殖,一、单项选择题.适于幼胚培养的胚发育阶段一般为（）A球形胚期以前B球形胚期到鱼雷形胚期C鱼雷形胚胚到拐杖形胚期D成熟胚期2.以下对于成熟胚的培养与培养基的关系叙述正确的是（）A要求较复杂的培养基成分B培养基中需要加入高浓度蔗糖C对培养基的要求简单D培养基中需要加入天然提取物.幼胚培养中，为了提供碳源，通常需要在培养基中加入一定量的（）A肌醇B蔗糖C维生素BD胚乳提取物.幼胚培养时，培养基中生长素对幼胚发育的关系描述准确的是（）A低浓度生长素对幼胚生长有促进作用，高浓度有抑制作用B高浓度生长素对幼胚生长有促进作用，低浓度有抑制作用C生长素对幼胚培养具有促进作用D生长素对幼胚培养具有抑制作用.下列培养实验中可能获得三倍体植株的是（）A小麦的茎尖培养B番茄花药