gsg-第二章-生物样品的制备

生物分析化学,2,第二章生物样品的制备,3,第二章生物样品的制备,生物分析化学分析对象的复杂性生物材料的选择激光捕获显微切割技术细胞的破碎生物大分子的提取生物大分子的分离与纯化固相萃取与固相微萃取样品的干燥样品的保存,1、生物分析化学分析对象的复杂性,生物材料的制备步骤,6,确定要制备的生物分子的目的和要求通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、化学以及生物学性质生物材料的破碎和预处理分离纯化方法的选择和探索选择相应、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备物的均一性（即纯度）的方法产物的浓缩、干燥和保存,基本原则：,以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得尽可能多的目标产品,物理、化学及生物学性质的考虑：1、水溶液和各种有机溶剂中的溶解性；2、不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性；3、对温度、含水量和冻干时的稳定性；4、分子的大小、带电的情况、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的扩散系数等；5、对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性等；6、对其他生物分子的特殊亲和力；7、组织及细胞内的定位分布等。,生物样品包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。,生物材料的选择,8,9,（1）制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。（2）选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。（3）动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。（4）植物要先去壳、除脂。（5）微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。（6）生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。,生物材料的选择,血液血样的采集（采动脉血好还是静脉血好？）血样的制备（如果你取血样会选择血浆、血清还是全血？）,生物材料的选择,10,生物材料的选择,11,全血(Wholeblood)：由液体成分的血浆和悬浮于其中的血细胞组成,合成为全血。主要用于血细胞成分的检查血浆(plasma)：离开血管的全血经抗凝处理后,通过离心沉淀,所获得的不含细胞成分的液体,即血浆。大部分临床化学检查和免疫学检查血清(serum)：离体的血液凝固之后,经血凝块聚缩释出的液体,即血清。粗略的说,血清与血浆的区别,主要在于血清不含纤维蛋白原。大部分临床化学检查和免疫学检查,（1）血浆的制备（2）血清的制备,血液的抗凝,采集全血或血浆样品时，在采血前应在采血管中加入抗凝剂，制备抗凝管。如用注射器采血，应在采血前先用抗凝剂湿润注射器。常用的抗凝剂有：草酸盐、枸橼酸钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、肝素。,分离血清,如分离血清，应将全血采集在试管中（不加抗凝剂），在室温下或25-37温水中斜置，血清析出后即可分离。血浆应在抗凝血采集后离心分离。,血样的处理,血液采集后应尽快送检和检测。不能立即送检的血样，血片应固定，抗凝血、血浆和血清应冷藏。送检血样应编号，并避免剧烈振摇,血液学检查项目与采血后可保存的时间,检查项目保存时间（h）白细胞计数23红细胞计数24血小板计数1网织红细胞计数23血红蛋白含量48红细胞压积容量24红细胞沉降速率23白细胞分类计数12,（二）尿液(urine)用于药物剂量回收、药物肾清除率及生物利用度的研究。,尿样注意酸败和细菌污染，4度冷藏和加入氯仿或甲苯防腐,14,生物材料的选择,尿液药物浓度变化大，应测定一定时间内尿中药物总量，尿液与血液中药物的相关性差。,（三）唾液1.唾液和唾液腺（唾液从哪里来？）2.唾液的组成3.疾病与药物对唾液组成、分泌的影响4.唾液的采集（用什么方法？）5.唾液样品的制备及特点,15,生物材料的选择,16,概念：唾液（saliva）：唾液腺的分泌物唾液斑（salivastain）：唾液干燥后形成的斑痕唾液来源：颌下腺约70%，腮腺约25%,舌下腺约5%，其余小唾液腺性状：无色、无味、接近中性（ph6.6-7.1）,17,成分：（水分占99.4%）有机物-粘/球蛋白质、氨基酸、尿素、尿酸、唾液淀粉酶、麦芽糖酶、血型物质无机物-钠、钾、氯、钙、铵、磷酸盐、碳酸盐、硫氰酸盐，其余为固形物（口腔脱落上皮细胞、大量细菌、食物残渣）分泌量：正常成年人每日分泌唾液约1.01.5升，分泌量及性质受精神因素、刺激的强度和性质及食物种类有关系。,18,应用价值：主要是个人识别和亲子鉴定方面。目的要求：是否唾液（斑）；个人识别,唾液（斑）检验,能否正确收集与保存唾液（斑）是检材能否正确鉴定的关键所在。,新鲜唾液的提取：应要求被鉴定人先漱口，再将纱布或棉拭子放人口中，浸湿后取出，立即置通风干燥处晾干，分别包装，作好有关的记录。也可将自然流出的唾液12mL，置干净容器内置冰冻保存，或者立即放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置4冰箱保存。,常用的唾液（斑）提取方法,（四）组织1.匀浆化法（简单，回收率低）2.蛋白沉淀法（简单，回收率低）3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物）4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的药物或毒物）,19,生物材料的选择,（五）头发1.头发构造2.头发的性质（广谱性、积累性、稳定性、依时性、相关性、指纹性）3.头发的采集与洗涤4.头发样品的制备,20,生物材料的选择,（六）其他生物样品1.乳汁（乳汁和新生儿）2.精液,21,生物材料的选择,激光捕获显微切割技术,激光捕获显微切割技术（laser-capturemicrodissection,LCM）是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、分离，获取均匀性很好的目标细胞（homogeneouscell），以用于后续研究的显微分离收集技术。,22,ARCTURUS公司,PixCellIieLCMSystem,LaserMicro-Dissection,Leica,LCM仪器,23,LCM基本操作,24,LCM的特点,LCM可以从任何组织中快速、精确地分离出纯的特异细胞及细胞群。利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。可以保证所取材料在一定层次上的同质性。适用于苏木素伊红染色（HematoxylinEosinstain,HEstain）、免疫组化、荧光标记等多种染色方式，可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。,25,A：大鼠子宫上皮H&E-染色的冰冻切片样品B：人空肠Cy2-Ab抗Cytokeratin上皮细胞冰冻切片样品C：石腊包埋H&E-染色的前列腺样品D：人血液中Giemsa-染色的白细胞样品E：大鼠小神经元细胞Nissl-染色的样品F：小鼠HistoGene-染色的肾小球冰冻切片样品,经各种染色方法从石蜡组织切片、冰冻组织切片等样品中切割的各种细胞的实例：,LCM实例,27,细胞的破碎,细胞破碎的目的：使被分离的分子充分地释放到溶剂中，与细胞中其它化合物和生物大分子分离，由固相转入液相，并且在过程中尽可能保持原有的生物活性。,不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。,细胞的破碎,机械法,物理法,化学与生物化学方法,研磨,组织捣碎法,反复冻融法,超声波处理法,冷热交替法,压榨法,自溶法,溶胀法,酶解法,有机溶剂处理法,29,30,(1)机械法1)研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。2)组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。,细胞破碎方法,31,(2)物理法1)反复冻融法：将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2)超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。多用于微生物材料，处理时间有数分钟到数十分钟不等，破碎细菌和酵母菌时，时间要长一些。3)压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。4)冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。,32,(3)化学与生物化学方法1)自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2)溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。3)酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。4)有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。,33,细胞破碎相关的器械与器材,1)电动组织捣碎机,原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。市售仪器多数是可调速机型，有不同口径、头端式样的转子供选择，平头转子适于制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制备组织和含纤维物质的匀浆。应用：一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械切力很大，制备较大分子样品很少使用。动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和细菌需加入石英砂加强效果。,34,超声波细胞破碎机,原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器。由超声波发生器和超声换能器两部分构成。相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满足0.1250ml的容量需要。应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡清洗及加速化学反应等。,35,2）超声波细胞破碎机,使用注意事项：1.长时间运转将产生过热，注意降温，可采用间歇处理方法（10-30秒）和冷却夹套选件。2.仪器发出的超声波是在液体中传递能量的，所以要保持超声换能器在液体中方能开机，避免在非液体环境中空转。3.使用后，须用蒸馏水冲洗净换能器头端。4.可能损伤细胞器，尤其是真核细胞的细胞器。,36,3）加压细胞破碎机,原理：利用高压使细胞悬液通过一个小孔（小于细胞直径的孔径）致使细胞被挤破、压碎，特别适用于厚壁细胞、细菌和较浓样品的破碎，具有快速、方便、无噪声的特点。主要技术参数电压：380V最大破碎压力：300Mpa,由于不同的生物体或同一生物体不同部位的组织，细胞破碎的难易程度不一，使用的方法也不相同。,生物大分子的提取,提取-在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态且不丢失生物活性的过程。,水溶液提取盐浓度、pH、温度防止蛋白酶或核酸酶的降解作用搅拌与氧化,有机溶剂提取,38,一、水溶液提取：稀盐和缓冲溶液对蛋白质等生物大分子的稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。考虑的影响因素如下：1、盐浓度（即离子强度）：在低离子强度的溶液中绝大多数蛋白质和酶都有较大的溶解度，此为“盐溶”现象；中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。2、pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值密切相关，一般提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内（pH=68），通常选择在偏离等电点的pH条件。,3、温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在05的低温操作。4、防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：可采用加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性。例如在提取DNA时加入EDTA络合Mg2+使DNAase失活。5、搅拌与氧化：采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的氧化变性失活。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸可以防止肽链上的巯基的氧化。,二、有机溶剂提取一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和较强的亲脂性。有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中。采用稀的有机溶液提取常常可以避免水解酶的破坏。,例：胰岛素的溶剂提取胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但组织样品中共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.53.0，进行提取，因为：乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca+pH2.53.0下糜蛋白酶活性低以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，还可同时除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。,目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小,由固相扩散到液相的难易,溶剂的pH,提取时间,影响提取的因素,极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂,碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂,温度升高，溶解度加大,远离等电点的pH，溶解度增加,43,由于样品可含有数千种乃至上万种生物分子同处于一个体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的一劳永逸的分离程序，但很多基本手段是相同的。常用的分离纯化方法和技术有：离心法、沉淀法（包括盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀和等电点沉淀法等）、透析法、超滤、冷冻干燥等。,生物大分子的分离和纯化,离心技术离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，将目标组分依据密度不同进行分离的技术。由于各种离心机转子的半径不同，离心力会发生变化，因此，常用相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）或“数字g”表示离心力。一般地，低速离心转速以rmin-1表示，高速离心以重力加速度g表示。,46,47,离心技术,离心力与相对离心力,沉降系数、沉降速度与K系数,离心技术的分类,梯度溶液的制备,48,离心技术,离心力,Fc,离心力centrifugalforce,离心加速度,颗粒质量,m,旋转角速度,X,颗粒离开旋转中心的距离,单位：,cm,2X,49,离心技术,相对离心力,RCF,相对离心力relativecentrifugalforce,转子每分钟的转数,n,g,地球重力加速度,单位：,980cms-2,X,离心转子的半径距离,单位：,cm,单位：,rmin-1,50,离心技术,沉降系数,颗粒在单位离心力作用下的沉降速度称为该颗粒的沉降系数（sedimentationcoefficient,s）。以10-13s作为一个单位，称为斯维得贝格单位（Svedbergunit）,或沉降系数单位，用s表示。,沉降系数是生物大分子的特征常数，除与颗粒的密度、形状和大小有关以外，还与介质的密度、黏度有关，因此，它与温度及浓度有着密切的依赖关系。,51,离心技术,沉降速度,沉降速度（sedimentationvelocity）是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。,粒子的沉降速度与粒子直径的平方、离子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加。,52,离心技术,K系数,K系数（Kfactor）是用来描述在一个转子中，将离子沉降下来的效率。也就是溶液恢复成澄清程度的一个指数，所以也叫“cleaningfactor”。,原则上，K系数愈小，愈容易、愈快将粒子沉降。K系数与离子转速及离子沉降的路径有关，所以K系数是一个变数。当转速或者离心管的溶液量不同，即粒子沉降的路径改变时，K系数就改变了。,53,离心技术的分类,差数离心法,速率区带离心法,等密度离心法,54,离心技术的分类,利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的离子分布沉淀。,差速离心法,55,离心技术的分类,根据分离的粒子在梯度液中沉降系数s的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带。在离心前，于离心管内先装入密度梯度介质，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。,速率区带离心法,56,离心技术的分类,根据颗粒密度的不同来进行分离的。在离心前，要预先配制介质的密度梯度液，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上和梯度液先混合，离心开始后，梯度液由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，原来分布均匀的离子也发生重新分布。,等密度离心法,57,梯度溶液的制备,梯度材料的选择原则,与需要被分离的生物材料不发生反应，即完全惰性，且易与所分离的生物离子分开。,可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，黏度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。,不会对离心设备发生腐蚀作用。,容易纯化，价格便宜或容易回收。,浓度便于测定，如具有折光率等。,对于超速离心分析工作来说，物理性质、热力学性质应该是已知的。,沉淀法基本原理：依据不同物质在溶剂中的溶解度不同以达到分离目的。常用的沉淀方法有以下几种：中性盐沉淀（盐析法）有机溶剂沉淀选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）等电点沉淀有机聚合物沉淀（使用聚乙二醇作为沉淀剂）,（1）中性盐沉淀（盐析法）定义：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀析出的过程。蛋白质在自然环境中通常是可溶的,60,中性盐沉淀（盐析法）,在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。,水化膜的破坏导致蛋白质分子间碰撞聚集。将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，使蛋白质周围的水化膜减弱乃至消失，蛋白质分子因热运动碰撞聚集。,中性盐沉淀（盐析法）盐析法机理：,破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀；中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力减弱，使蛋白溶解度降低，导致蛋白质分子之间聚集而沉淀。,中性盐沉淀（盐析法）盐析法机理：,（1）中性盐沉淀（盐析法）盐析常用的盐：主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸二氢钠等。实际应用中以硫酸铵最为常用。离子强度大，盐析能力强；溶解度大且受温度的影响小；不易使蛋白质变性；价格低廉。,影响因素,（1）中性盐沉淀（盐析法）盐析的影响因素：盐的饱和度：不同的蛋白质，结构和性质不同，故盐析所需的饱和度不相同。蛋白质浓度：混合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果就越差。一般控制在0.2%2%为宜。pH值：蛋白质在等电点处溶解度小。选择在被盐析的蛋白质的等电点（pI）附近。温度：一般在室温下进行。,（1）中性盐沉淀（盐析法）盐析的特点：（1）优点：室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，无机盐不易引起蛋白质变性失活；非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；使用范围广，几乎所有的蛋白质都能采用；设备简单，操作方便。（2）缺点：沉淀物中含有大量盐析剂；分离效果不理想，只是作为初步的分离纯化。,66,盐析的影响因素,若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。,对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，其共沉淀作用下，分离纯化效果较好，但回收率会降低。,高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来。,蛋白质所带静电荷越多，它的溶解度就越大。,远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小,多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。,低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。,蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，溶解度反而减小。,（2）有机溶剂沉淀定义：向水溶液里加入一定量亲水性有机溶剂，降低溶剂的溶解度，使蛋白质沉淀析出的分离纯化方法。,机理：亲水性有机溶剂加入后降低了溶液的介电常数，减小了溶剂的极性，从而消弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质间的相互作用，导致蛋白质因溶解度降低而沉淀。,使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解与水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水化膜，使蛋白质沉淀。,（2）有机溶剂沉淀优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀；沉淀无需脱盐，过滤比较容易。缺点：容易使某些具有生物活性的大分子变性失活，操作需在低温下进行。沉淀蛋白质最常用的有机溶剂：乙醇、丙酮和甲醇。,（2）有机溶剂沉淀影响因素：温度：为防止生物大分子在较高温度时发生变性，一般要求在低温下进行，同时还要考虑有机溶剂与水混合时的放热现象。有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓；样品浓度：通常使用520mgmL-1的蛋白质初浓度；pH：等电点时，蛋白质的溶解度最低。通常选择pH值在等电点附近；离子强度：重要因素。盐浓度过高会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。,（3）选择性沉淀定义：利用蛋白质、酶等生物大分子与非目的的生物大分子在物理、化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而达到分离提纯的目的。常用的选择性沉淀方法：热变性：利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法简便，不需消耗任何试剂，但分离效率低，常用于生物大分子的初期分离纯化。表面活性剂和有机溶剂变性酸、碱变性,（4）等电点沉淀法定义：是利用蛋白具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，因此单独使用此法效果不理想，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其它沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目标蛋白。,（5）有机聚合物沉淀法（聚乙二醇沉淀法）机理：水溶性非离子型聚合物，可使蛋白质发生沉淀作用；优点：条件温和，不易引起蛋白质变性，沉淀较完全，应用范围广。缺点：易受各种因素，如pH、离子强度、蛋白质浓度及聚乙二醇分子量的影响。,定义：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。袋内：大分子量的生物大分子袋外：盐和小分子物质不断扩散透析到，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。多次更换透析液，使用磁子搅拌。,透析生物化学实验室最简便、最常用的分离纯化技术。,在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。,透析的动力：扩散压,74,透析用器材,透析用器材仅涉及透析膜：常用有动物膜、羊皮纸、火棉胶、玻璃纸以及最近使用的赛璐玢膜都是用纤维或纤维素衍生物制成的。,透析膜的特点：1.在溶剂中能膨胀形成分子筛状多孔膜，只允许小分子溶质和溶剂通过，而阻止大分子通过。2.具有化学惰性，不具有能与溶质起作用的基团，在水、盐溶液、稀碱或稀酸中不溶解。3.有一定的机械强度和良好的再生性。,75,透析膜的处理：,1.从成卷的透析膜中剪下适用的长度（一般20-30厘米）。2.用过量的10mmol/L碳酸氢钠湿润透析膜并煮沸几分钟。（处理掉表面甘油）3.在10mmol/LNa2EDTA中煮沸几分钟，重复一次。也可在稍加搅拌下浸泡30分钟替代煮沸。（处理掉膜上金属离子）4.用蒸馏水或超纯水清洗数次。5.置20%-50%乙醇溶液中，储存于4，以防能分解纤维素的微生物生长。,76,注意事項：*操作时必需戴手套*,1.取出透析袋要先用蒸馏水清洗干净，绑透析袋前要先试装蒸馏水，看透析袋有沒有蛀孔，會不會有水喷出。绑透析袋不要太用力拉扯，否则透析袋可能会裂。,2.一般透析至少要3h，至少要换两次透析液(100至1000倍样品体积)才能完全。,3.注意离心管的离心转速不能太快，否則薄膜很容易破裂。,4.每次离心浓缩后，暂时不要丟掉外滤液(filtrate)，收集起來以防薄膜破裂流失。,77,超滤,在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，并使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。,优点：操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂；实验条件温和，可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。缺点：不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到1050的浓度。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。,比较,79,超滤技术的关键是膜常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH114都是稳定的，且能在90下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用12年。超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2h)）；截留率（以百分率表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。,80,超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。常用有真空透析超滤、离心浓缩超滤、加压搅拌室超滤、切向流系统超滤。,81,超滤装置,本装置由蠕动泵、超滤器、压力表、调压阀及相应管路等组成。1、试样2、蠕动泵3、超滤器4、超滤液5、调压阀6、隔膜压力表,透析扩散原理半透膜（纤维素)-大分子被截留，盐和小分子扩散通过更换透析液，磁子搅拌用于样品除盐、少量有机溶剂、生物小分子等；保留液体积经常增加（可达50%）,超滤加压膜分离技术，一定压力下小分子溶剂和溶质透过一定孔径的膜（乙酸纤维或硝酸纤维），而大分子不能通过生物大分子的脱盐，脱水和浓缩(10-50%的蛋白质浓度),固相萃取,固相萃取一、定义萃取法（Extraction）：就是从样品中提取组分，传统的方法是液-液萃取，即用液体作为提取剂。固相萃取（SolidPhaseExtraction,SPE）：利用固体吸附剂将样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。,固相萃取与固相微萃取,与液-液萃取相比，固相萃取具有如下优点：有机溶剂消耗量低，可减少对环境的污染；采用高效、高选择性的吸附剂，能更有效的将分析物与干扰组分分离；无相分离操作过程，容易收集分析物；能处理小体积试样；操作简便、快速，费用低，易于实现自动化及与其他分析仪器连用。缺点：目标化合物的回收率和精密度都要低于液-液萃取。,二、固相萃取的基本原理,固相萃取的基本原理：样品在两相之间的分配，即在固相（吸附剂）和液相（溶剂）之间的分配。固相萃取保留或洗脱的机制：被分析物与吸附剂表面的活性基团，以及被分析物与液相之间的分子作用力。洗脱模式有两种：一种是目标化合物比干扰物与吸附剂之间的亲和力更强，因而被保留，洗脱时采用对目标化合物亲和力更强的溶剂；另一种是干扰物比目标化合物与吸附剂之间的亲和力更强，则目标化合物被直接的洗脱。通常采用前一种洗脱方式。,固相萃取的操作步骤,一个完整的固相萃取步骤包括固相萃取柱的预处理、上样、洗去干扰物质、洗脱及收集分析物四个步骤。,目的：一是为了润湿和活化固相萃取填料，二是为了除去填料中可能存在的杂质，减少污染。采取的方法：用一定量溶剂冲洗萃取柱。,固相萃取柱的预处理：,固相萃取基本装置,固相萃取的基本装置包括固相萃取柱和固相萃取过滤装置。固相萃取柱是整个固相萃取装置的核心。,商品化的固相萃取柱外形类似于一个注射器针筒，可自行填装固相萃取柱。,固相萃取吸附剂的选择原则,多孔的、具有大的表面积的固体颗粒；较低的空白值；有高的化学稳定性；与样品溶液有好的界面接触；萃取吸附过程必须可逆且有高的回收率。,固相萃取方法的建立,键和硅胶吸附剂石墨碳离子交换树脂金属配合物吸附剂聚合物吸附剂免疫亲和吸附剂分子嵌入聚合物,常用固相萃取吸附剂,固相萃取溶剂的选择,在固相萃取固定相活化、上样富集、淋洗杂质、分析物洗脱过程中，都涉及到溶剂选择问题。,1）固定相活化溶剂的选择,一般使用两种活化溶剂。第一种溶剂（初始溶剂）用于净化固定相，对于常用的C18键和硅胶固定相，可用甲醇有效地除去其所含杂质。第二种溶剂（终溶剂）使固定相溶剂化，以便样品中的分析物能更好的保留。,2）淋洗溶剂的选择,淋洗溶剂用于洗去吸附在固定相上的干扰组分。淋洗溶剂的强度选择非常重要，其强度应大于或等于上样溶剂，又小于洗脱溶剂。淋洗溶剂的选择原则：尽可能将干扰组分从固定相上洗脱完全，但又不能洗脱任何分析物。,溶剂强度应足够大，以保证吸附在固定相上的分析物定量洗脱下来；选择的洗脱溶剂应与后续的分析相适应；选择粘度小、纯度高、毒性小并与分析物和固定相不发生反应的溶剂；选择单一溶剂效果不理想时，可以考虑使用混合溶剂进行洗脱。,3）洗脱溶剂的选择,固相萃取的分离模式及应用,反相固相萃取正相固相萃取离子交换萃取免疫亲和,反相固相萃取,吸附剂（固定相）是非极性或弱极性的，流动相为极性（水溶液）或中等极性样品基质。吸附剂的极性小于洗脱液的极性。作用机理：目标化合物与吸附剂间存在疏水性相互作用，如范德华力或色散力。应用：可以从强极性的溶剂中（如水样）萃取非极性或弱极性的化合物。,正相固相萃取,吸附剂都是极性吸附剂，流动相为中等极性到非极性样品基质。目标化合物在吸附剂上的保留程度取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用。作用机制主要包括：1）氢键，-键相互作用2）偶极-偶极相互作用3）偶极-诱导偶极相互作用应用：从非极性溶剂样品中萃取极性化合物。,离子交换固相萃取,离子交换固相萃取用于萃取分离带有电荷的分析物。固定相为带电荷的离子交换树脂，流动相为中等极性到非极性样品基质。分析物与吸附剂间的作用是静电吸引力。离子交换固相萃取分为阴离子交换固相萃取和阳离子交换固相萃取。,免疫亲和,即将抗体偶联到固相载体而制成免疫亲和层析柱，可对样品中能与抗体结合的特异性抗原分子进行分离、纯化。例：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。金黄色葡萄球菌蛋白A（ProteinA）能够与免疫球蛋白G（IgG）结合，可以用于分离各种IgG。,固相萃取的应用,固相萃取在环境分析的应用；例如，多环芳烃、农药残留等有机污染物的检测。固相萃取在生物样品分析中的应用；例如，生物检材中毒物和药物残留分析、血液中药物分析和药物动力学研究。固相萃取在食品分析中的应用。,SPE,杂质少,避免乳化,高萃取率,柱子可弃,样品量小,易于自动化,价格高,技术要求高,批之间有差异,柱子易堵塞,97,SPE法的优缺点,与固相萃取技术比较：固相微萃取操作更筒单、携带更方便，克服了固相萃取回收率低、吸附剂孔道易堵塞的缺点，成为目前所采用的试样预处理中应用最为广泛的方法之一。SPME已开始应用于分析水、土壤、空气等环境样品的分析。,固相微萃取,SPME的原理,以熔融石英光导纤维或其它材料为基体支持物，采取“相似相溶”的特点，在其表面涂渍不同性质的高分子固定相薄层，对待测物进行提取、富集、进样和解析。然后将富集了待测物的纤维直接转移到仪器(一般是GC，或HPLC)中，通过一定的方式解吸附(一般是热解吸，或溶剂解吸)，然后进行分离分析。,该装置类似微量注射器，由手柄和萃取头（纤维头）两部分组成。萃取头是一根长约1cm、涂有不同固定相涂层的溶融石英纤维，石英纤维一端连接不锈钢内芯，外套细的不绣钢针管（以保护石英纤维不被折断）。,SPME装置及萃取步骤,SPME操作包括三个步骤：1）涂有固定相的萃取头插入样品或位于样品上方；2）待测物在固定相涂层与样品间进行分配直至平衡；3）将萃取头插入分析仪器的进样口，通过一定的方式解析后进行分离分析。,涂层材料SPME萃取过程依赖于分析物在涂层和样品两相中的分配系数，因此萃取的选择性取决于涂层材料的特性，涂层材料是SPME技术的核心。不同种类的分析物要选择不同性质的涂层材料，选择的基本原则是“相似相溶”。选择涂层时应注意：对有机分子有较强的萃取富集能力合适的分子结构，有较快的扩散速度良好的热稳定性,SPME的影响因素,其它因素,萃取温度SPME表面吸附过程一般为放热反应，低温适合于反应进行。萃取时间不同的待测物达到动态平衡的时间长短，取决于物质的传递速率和待测物本身的性质、萃取纤维的种类等因素；挥发性强的化合物在较短时间内即可达到分配平衡，而挥发性弱的待测物质则需要相对较长的平衡时间。,搅拌强度增加传质速率，提高吸附萃取速度，缩短达到平衡的时间；磁力搅拌，高速匀浆，超声振动。盐效应盐析手段(加NaCl或Na2SO4)可提高本体溶液的离子强度，提高极性有机待萃物的萃取灵敏度。溶液pH值溶液酸度应该使待萃物呈非聚合单分子游离态，使涂层与本体溶液争夺待萃物的平衡过程极大的偏向吸附涂层。,四、特点优点：集取样、萃取、浓缩和进样于一体，操作方便，测定快速高效；无需任何有机溶剂，是真正意义上的固相萃取，避免了对环境的二次污染；仪器简单，适于现场分析，也易于操作。缺点：定量检测精确度不高；可重复性不高；商业可用负载聚合物品种少。,107,萃取方法的选择,亲脂性,酸碱性,解离性,亲脂、酸性或中性硅胶、大孔树脂等亲脂、碱性大孔树脂亲水、可解离离子交换树脂亲水、不解离沉淀蛋白直接进样,108,干燥,常压干燥：是指在密闭的空间或干燥器内使用干燥剂进行的干燥。,1.无水硫酸钠：中性，价廉，吸水量大，但作用慢，效力差。2.无水硫酸镁：中性，效力中等，作用快，吸水量大。3.无水硫酸钙：作用快，效率高。与有机物不发生反应，不溶于有机溶剂，缺点是吸水量小，可用于二次干燥。4.固体氢氧化钾（或钠）：可吸收水、氨和胺类。钾比钠的吸水能力大60-80倍。5.五氧化二磷：吸水、效力最高、作用非常快，但价格较贵。6.氧化钙：即生石灰，碱性，吸水后成为不溶的氢氧化物，价廉7.分子筛：泛指具有均一微孔而能选择的吸附直径小于其孔径的分子的那些吸附剂。如沸石分子筛，碳分子筛等，其中常用沸石分子筛。,109,常用干燥剂及其作用,110,真空干燥,原理：在抽真空的容器中压力降低则溶剂的沸点也就降低，蒸发速度加快。适用于干燥不耐热的样品。实验室内常可利用的组合器材有：真空干燥器（箱）、冷凝管及真空泵。,1.市售有玻璃和特殊塑料两种。2.真空度不宜过高.以上盖推不动即可.3.使用新的干燥器前，一般先须作耐压试验。4.处理危险或有毒样品时，干燥器外应罩铁丝网或用布包扎。5.打开干燥器取样时放入空气不要过快，以免冲散样品。也可在通气口处放一小片洁净滤纸。6.选择合适干燥剂，待干燥物所含溶剂不止一种时，可在干燥器内同时放两种干燥剂。,真空干燥箱,真空干燥器,111,冷冻干燥,概念：亦称“冻干”，即先将溶液或混悬液冷冻成固态，然后在低温和高真空度下使冰升华，留下干燥物质的过程。原理：水有固态、液态、气态三种态相。根据热力学中的相平衡理论，随压力的降低，水的冰点变化不大，而沸点却越来越低，向冰点靠近。当压力降到一定的真空度时，水的沸点和冰点重合，冰就可以不经液态而直接汽化为气体，这一过程称为升华。冷冻干燥就是基于这一原理。,112,冷冻干燥的特点,1.在低温高真空度下进行，样品不起泡，不爆沸。干物不粘壁，易取出，而且成为疏松的粉块，极易溶于水。2.适于对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的样品（如：蛋白质、酶、核酸等）3.并非所有生化物质都能在冻干时稳定。冻干前应先小量试验。,113,应用干燥罐进行冷冻干燥的步骤,1.将待干燥样品置于培养皿样容器内（厚度不超过1cm），先在冰箱内冻成硬块。2.准备真空干燥器，内置两个培养皿分别放固体KOH(NaOH)及P2O5,迅速取出冻块放