9实验九 大豆脲酶提取与动力学研究-袁永泽-2010-04-14.ppt.gzip.ppt

大豆脲酶制备与动力学研究,生物化学与分子生物学教研室指导教师：袁永泽,生物技术大实验,一、实验目的,1、掌握脲酶提取的基本方法2、掌握脲酶活性检测方法3、掌握脲酶动力学研究的实验原理作图法求取动力学参数(Km、Vmax)4、理解底物浓度、pH以及抑制剂对酶Km的影响、利用作图法判断抑制类型,二、实验原理,1、脲酶（urease）的基本生化性质,脲酶广泛分布于植物种子中，也存在于某些微生物中。刀豆、大豆、黄豆中含量丰富。脲酶催化脲的水解反应，专一性高，生成氨与CO2。脲酶为寡聚酶，分子量约为483KD,等电点为4.8,最适pH7.0。Km与来源及测定条件有关，参见表1。,表1脲酶Km与来源、测定条件的关系,二、实验原理,2、脲酶活性测定原理,脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH7.0。反应式：（NH2)2CO+H2O2NH3+CO2氨与奈氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。故可以测定脲酶活力的大小。反应式：NH3H2O+2K2HgI4+3KOHHgOHgNH2I+7KI+3H2O（纳氏试剂）（碘化氨氧合汞）,奈氏试剂法试剂昂贵但较为精确,三、实验器材与试剂,1.粉碎机、试管、烧杯、离心机(离心管)、分光光度计等。2.脲酶提取液（粗酶液），使用时可以磷酸缓冲液适当稀释。3.标准脲（尿素）溶液：0.01,0.02,0.04,0.08mol/L。3%脲的磷酸盐溶液（5.4%磷酸氢二钠-4.25%磷酸二氢钾）4.磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.0）：0.1,0.4,0.8mol/L。5.Tris-H2SO4缓冲液：50mmol/L,pH5,6,7,8,9。6.标准硫酸铵溶液：40mmol/L（即40mmol/ml）7.奈氏试剂：配制方法参见教材；注意离心取上清，避光储于棕色瓶中备用。8.人造沸石、2%乙酸、32%丙酮9.10%（W/V）三氯乙酸（沉淀蛋白、终止酶反应！）,1、脲酶的提取称取5g人造沸石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡两次，倾去酸，用蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。称取10g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造沸石，再加入50ml32%丙酮溶液，冰浴中持续摇动15-20min，4、10,000rpm离心15min，收集上清液备用。向中沉淀加入10ml32%丙酮溶液，重悬，复抽提一次（操作同上），两次上清合并，即为粗酶液。,四、实验内容与操作步骤,2、脲酶活性的测定,结果与分析脲酶活力（U/ml）=式中：n为酶样品的稀释倍数请思考下面三个问题，这对保证本实验的完成质量很重要!根据上述计算公式，脲酶活力单位如何定义？你认为上述实验获得的脲酶活性数据严格吗？如果不够严格，你认为应如何改进实验?在测活操作中，是否有因素影响结果的准确度？如有不利因素，应如何克服？,3、脲酶动力学研究,底物浓度对脲酶反应速度的影响Km和Vm的测定原理：酶的Km和Vm是酶反应动力学重要参数。Km是酶的特征常数（与反应条件有关）。利用不同底物浓度S下测得的反应速度v,以S/v对S作图，或以双倒数作图，可测定脲酶的Km和Vm。,这里，需准备另外6只洁净的试管。,结果与分析将测定结果列表：以S/v对S作图，求取Km和Vm。思考：上述动力学参数的求取在实验设计上是否严密？若不够严密，请你提出改进的方案。,pH对脲酶催化速度的影响取7只干燥试管，标以1-7序号。在1-5管中各加入0.5ml0.1mol/L脲溶液，再分别加入1ml0.1mol/L的pH5，pH6，pH7，pH8，pH9的Tris-硫酸缓冲液，室温平衡5分钟后，分别加入0.5ml酶溶液，混匀。再于室温反应5分钟，然后在各管立即加入0.5ml10%三氯乙酸，终止反应，混匀，按前法取出1.0ml离心，取一定体积的上清与奈氏试剂显色。6号管加入0.3ml标准硫酸铵溶液与0.2ml蒸馏水，7号管加入0.5ml蒸馏水作为空白，6、7号管各加1mlH2O代替Tris硫酸缓冲液。室温平衡、加酶液等操作与15号管同时进行。分别由各管吸取0.2ml反应液依次加入另17各管中，各加4.3mlH2O，摇匀，再加0.50ml奈氏试剂，摇匀。测A480，并计算反应速度。以v为纵坐标，pH为横坐标作出v-pH图，求脲酶最适pH。,请在实验记录本上列出加样表，再进行实验操作。,抑制剂对脲水解速度的影响取14只干燥试管，各管标号，按下表加样。,同前法分别在各试管中加入0.5ml脲酶提取液，25保温5min，立即加入0.5ml10%三氯乙酸，按前法取样、离心备用。同时，制作标准管（第14号管）。从每只试管中取出0.5ml反应液，依次加入另113试管中，各加入4.30mlH2O，摇匀