细胞工程二--实验室PPT课件

.,1,第二章动物细胞工程实验室基础,实验室设置器材的清洗和消毒无菌操作技术培养基组成及配制,.,2,与植物细胞工程实验室设置上的区别：,基本相同；不同-对气体的要求。动物细胞培养的是单细胞。,一、动物细胞工程实验室的设置,.,3,动物细胞工程的实验室要求严格：必须保持无菌的环境、规范的无菌操作过程、严格的外界条件控制。具体将细胞培养的整个过程分为6个方面：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒和灭菌、观察和储藏等。无菌操作必须分室处理。,.,4,清洗灭菌室：本间不要求无菌环境。容器具洗涤灭菌,培养用液配制等.主要大型仪器有高压蒸汽灭菌锅,电热干燥箱、蒸馏水处理器、酸缸、冰箱等.,.,5,制备室：培养基及有关培养用试剂的制备。需要相对无菌的操作，尤其是制备培养基用的水必须无菌；所用器材尽量作到无菌要求。通常用到的器材有天平、磁力搅拌器、pH计等。配制好的培养液通常需要在无菌操作台内过滤除菌并进行分装。注意分装非常重要。,.,6,储藏室：储藏室的基本要求是材料的取放方便、清洁无尘。主要的器材：冰箱（常用及超低温）、液氮罐、储物柜等。,.,7,培养室：是细胞培养实验中对无菌操作最为严格的一个环节。无菌操作室是相对密封、防尘、防菌的工作间，在结构和消毒方面有其基本要求。应包括更衣间、缓冲间、操作间。,.,8,细胞学鉴定室（分析室）：对培养物的观察分析和培养物计数等。一般设在培养室的隔壁。对无菌没有无菌操作间严格，但同样需要防尘以及相对无菌的清洁环境。放置显微镜、打印机及其它分析设备等。,.,9,细胞培养实验室,1.准备室2.缓冲室,准备室,风淋,3.培养室,.,10,动物细胞工程的实验室设置,制备存储、观察和培养室,清洗、消毒室,无菌操作室,.,11,常用的仪器设备:,倒置显微镜,超净工作台,CO2培养箱,冰箱,细胞计数板,离心机,细胞冷冻储存器,压力蒸汽消毒器,电热干燥器箱,过滤除菌装置,纯水仪,.,12,超净工作台,侧流式(或称垂直式),外流式(或称水平层流式),.,13,.,14,外流式超净工作台,.,15,二氧化碳培养箱通过对周围环境条件的控制制造出一个能使细胞/组织更好地生长的环境，条件控制的结果就会形成一个稳定的条件：如恒定的酸碱度（pH值：7.2-7.4）、稳定的温度（37C）、较高的相对湿度（95）、稳定的CO2水平（5%）。,CO2培养箱,.,16,使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净，定期消毒。箱内水槽中：灭菌蒸馏水3000毫升以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,.,17,CO2培养箱,.,18,.,19,倒置显微镜,.,20,液氮容器,.,21,电热干燥器箱,.,22,.,23,纯水仪,.,24,培养用器皿,培养器皿：供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。,.,25,培养瓶：由玻璃或塑料制成，主要用于培养、繁殖细胞。国产培养瓶的规格常以容量表示，如：250ml、100ml、25ml等；进口培养瓶则多以底面积（cm2）表示。培养皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或作细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞增殖等实验使用。分直径30mm、60mm、120mm等。多孔培养板：可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本。常用的有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。,.,26,液体储存瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。常用规格有500ml、250ml吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种，除可作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀传代细胞加样器：用于吸取、移动液体或滴加样本。常用微量加样器，可保证实验样品含量精确，重复性良好。离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等,.,27,其它用品尚有放置试剂或临时插置吸管用的试管，装放吸管以便消毒的大玻璃筒，用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝饭盒或贮槽，套于吸管顶部的橡皮吸头，封闭各种瓶、管的胶塞、盖子，冻存细胞用的安瓿或冻存管，不同规格的注射器，烧杯和量筒以及漏斗等。器械,.,28,.,29,.,30,.,31,.,32,二、器材的清洗与消毒,清洗的主要目的是消除接触细胞的器皿上表面的杂质和微生物等成分。清洗完毕后的器皿在消毒之前必须进行严密包装，以便消毒及存储，防止灰尘及消毒后再次被污染。消毒-严格的消毒，包括器皿和培养基是必须的。超净台和无菌间的大面积消毒主要通过紫外灯；玻璃器皿、滤器、胶塞、解剖用具、塑料枪头等多通过高压蒸汽灭菌；培养基因为其中含有不耐热成分，所以多通过过滤除菌，器皿的入口、移液器、操作者的手套等多为化学消毒。,.,33,1、玻璃器皿的清洗与消毒,浸泡-自来水浸泡、5%盐酸过夜。（细胞培养用过的玻璃瓶要立即浸泡到自来水中，防止干涸）。洗刷-浸泡过的玻璃瓶，用软毛刷在洗衣粉中洗刷，不要留下死角。干燥浸酸：通常用重铬酸钾/浓硫酸/水以12：20：100（g:ml:ml）配制成酸洗液。洗刷过的玻璃器皿在其中浸泡过夜。冲洗：自动洗涤装置冲洗或手工操作倒置于防尘箱中凉干，牛皮纸包装，高压灭菌，50-70烘干备用,.,34,清洁液可根据需要,配制成不同的强度,常用的下列三种:重铬酸钾(g):浓硫酸(ml):蒸馏水(ml)(A)强清洁液63:1000:200(B)次强清洗液120:200:1000(C)弱清洁液100:100:100.清洁液配制时应注意安全,须穿戴耐酸手套和围裙,并要保护好面部及身体裸露部分.配制过程中可使重铬酸钾溶于水中,然后慢慢加浓硫酸.并不停的用玻璃棒搅拌,使产生的热量挥发,配制溶液应选择塑料制品.配成后清洁液一般为棕红色.,.,35,2、胶塞的清洗与消毒,新胶塞应先在自来水中冲洗。2%NaOH煮沸20min。自来水冲洗，1%HCl浸泡20min，蒸馏水冲洗后凉干，牛皮纸包装高压灭菌（11510-15min），50-70烘干备用。,.,36,3、塑料器皿的清洗,组织培养使用的塑料器皿主要有培养板、离心管及培养瓶等。这些产品多为一次性商品。若需重复使用，器皿经冲洗干净后，晾干，2%NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5%盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗，蒸馏水漂洗枪头：装盒后，包装高压灭菌，50-70烘干备用。,.,37,4、不锈钢滤器的清洗与消毒,自来水冲洗30min，三蒸水冲洗，浸泡过夜，防尘箱中凉干，锡箔包装后再牛皮纸包装，高压灭菌，50-70烘干备用。,.,38,5、金属器材,金属器皿不能泡酸，洗涤时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压消毒，再烘干备用。,.,39,体外培养细胞无抗感染的能力，所以防止污染是决定培养成功与否的首要条件。为做到防止污染，要求实验者在培养工作的每一个环节都必须做到最大限度的无菌。,三、动物细胞培养的基本技术-无菌操作,.,40,1、实验前的准备-培养用品的消毒-实验器具-参照前面说明。根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培养、血白细胞培养、传代培养等，准备培养所需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒灭菌。-培养室的消毒培养室每天用0.2%的新洁尔灭或2%5%的来苏儿拖洗地面一次（拖布专用），30瓦紫外灯管照射消毒2030分钟。-超净工作台的消毒超净工作台台面每次实验前用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟。,.,41,2、洗手和着装利用超净工作台进行培养时，在培养前换上培养室专用的工作服和拖鞋，清洗双手，然后用75%酒精棉球擦洗双手。平时观察细胞可以用经紫外照射的工作服。,.,42,3、无菌培养操作-为保证无菌，除实验所需物品需预先消毒外，实验中还需保持无菌操作，操作幅度尽可能小。-工作台面上的用品要布局合理，品摆放应该有规律，酒精灯在中间，原则上是右手使用的东西置右侧，左手使用的东西置左侧，酒精灯置中央；实验操作应在操作台中央无菌区域内进行。-实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧灼进行。,.,43,注意：（1）烧过的器械要冷却后才能使用，如镊子应冷却后才能夹取组织，否则可能造成组织细胞损伤；塑料、橡胶器件宜用75%酒精擦洗，勿将酒精接触里面。胶塞、橡皮头等过灯时时间要短，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。（2）已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内培养液中的蛋白质等成分烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带如培养液中；（3）开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞；,.,44,（4）进行培养操作时，不要用手触及已消毒物品，如不慎接触，要用火焰烧灼或取备用品更换（5）吸取不同液体、处理不同的细胞要用不同的吸管，以避免液体间、细胞间的交叉污染。（6）面向操作野时勿大声讲话或咳嗽，以免喷出的唾沫把细菌等带入工作台面造成污染。（7）操作人员应注意自身安全。（8）操作完毕后，清理物品，75%酒精擦洗台面。,.,45,培养基基本要求,营养成分:氨基酸、维生素、单糖、其它成分,促生长因子和激素,pH：最适为7.2-7.4，,渗透压,四、动物细胞培养基的组成及配制,无菌,.,46,（一）培养基的成分动物细胞对培养基要求高葡萄糖、必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、细胞生长因子及激素等。,.,47,1.葡萄糖：碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分.主要有葡萄糖,核糖,脱氧核糖,丙酮酸钠和醋酸等。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。,.,48,2、氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。在培养基中添加至少12种必须氨基酸。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源.,.,49,3.维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。,.,50,4.无机离子与微量元素：培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡.此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能.培养液的渗透压是一个非常重要的因素.细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。,.,51,5、生长因子和激素,已证实：各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。,.,52,(二）常用培养基,动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。,.,53,1天然培养基血清：常用胎牛血清（FBS）、小牛血清（CS），一般浓度10。鸡血浆：含纤维蛋白原和一些营养成分水解乳蛋白鼠尾胶原,优点：营养成分丰富，培养效果良好。缺点：成分复杂，个体差异大，来源有限,.,54,动物细胞培养中血清的作用,（1）营养提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。（2）提供结合蛋白，结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。（3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和伸展因子，使细胞很好地贴壁（4）保护提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。（5）解毒血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。,.,55,血清的缺点：成分复杂，影响实验分析。,血清的消毒：过滤除菌,血清的储存：4，或-20以下长期存放。,.,56,血清可能引发的问题,（1）所有的血清都是一种成分不确定的混合物，批与批血清之间的组分存在差异；（2）血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。(血清来源于动物，有可能携带传染源，包括病毒和有毒物质，对正在生长的细胞系或者制品带来风险),.,57,（3）血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。,.,58,2、合成培养基,人工合成培养基是细胞培养基的基础培养液。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。,.,59,人工合成培养基，常用如下(1).MEM(minimumessentialmedium)细胞培养基系列(2).DMEM（DulbeccosmodifiedEaglemedium)细胞培养基系列(3)RPMI-1640细胞培养基系列(4).M199细胞培养基系列(7)F-10,F-12细胞培养基系列(8)DMEM-F12,.,60,由基础培养基和替代血清的补充成分组成.,无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。,3、无血清培养基,.,61,1)无血清培养基的添加成分,细胞外基质：帮助细胞附着和贴壁。,酶抑制剂：保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。,生长因子和激素：促细胞生长和增殖。,结合蛋白和转运蛋白：常见如牛血清白蛋白。,.,62,2）使用方法:细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。,.,63,使用无血清培养基的优点(1）可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的准确性、重复性。（2）避免血清源性污染。（3）避免血清组分对实验研究的影响。（4）有利于体外培养细胞的分化。（5）可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。,.,64,已应用的领域有：（1）研究细胞的分化条件；（2）用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究；（3）用于从多种细胞混杂的培养基中选择目的细胞；（4）肿瘤病理学和病因学的研究；（5）用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品。缺点：主要表现为细胞的适用范围窄，细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响。,.,65,(三）细胞培养的其他常用溶液,1、水与平衡盐溶液（balancesalinesolution,BSS）：1）培养用水:体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应使用经石英蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。存放时间一般不应超过2周。,.,66,2.平衡盐溶液：主要是由无机盐、葡萄糖组成。作用：提供缓冲系统，维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定提供细胞生存所需的能量和无机离子成分。用于洗涤组织、细胞的漂洗、配制其他培养用液。,.,67,几种常用的BSS,RingerPBSEarleHanksD-Hanks配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。,.,68,3、PH调整液：NaHCO3是培养基中必须添加的成分，溶液用3.7%、5.6%、7.4%NaHCO3溶液HEPES液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸），使用终浓度为0.010.5mol/L。HEPES是一种非离子两性缓冲液,其在pH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。，一般培养液内含20mmol/LHEPES