生物DNA的粗提取与鉴定课件

5.1 DNA的粗提取和鉴定，1。基础知识，(DNA提取方法，1。提取生物大分子的基本思想，选择某些物理或化学方法来分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。(1)在不同浓度的氯化钠溶液中，脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸和蛋白质的溶解度是不同的。通过使用这一特征，通过选择合适的盐浓度，可以完全溶解DNA并沉淀杂质。或者让其他成分溶解，进行脱氧核糖核酸沉淀。(2)脱氧核糖核酸不溶于酒精溶液，脱氧核糖核酸不溶于酒精溶液，但细胞中的一些蛋白质溶于酒精。DNA和蛋白质被进一步分离。(3)脱氧核糖核酸对酶、高温和去污剂的耐受性，(1)蛋白酶水解蛋白质，对脱氧核糖核酸没有影响，(2)大多数高温的蛋白质不能耐受60 80，脱氧核糖核酸在80以上不会变性，(3)去污剂溶解细胞膜，去除脂类和蛋白质，但对脱氧核糖核酸没有影响，(2)脱氧核糖核酸鉴定，脱氧核糖核酸在沸水浴中暴露于二苯胺时被染成蓝色。(1)实验材料的选择，原则上从以下材料中选择2 3种材料：花椰菜、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆和菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血和哺乳动物红细胞；对于在液体培养基中培养的大肠杆菌，对于所有含有DNA的生物材料，可以考虑具有相对高的DNA含量的组织，其容易获得、分散或分散细胞，容易破碎或研磨细胞，并且容易在细胞核中释放DNA。(2)破碎细胞，得到含有DNA的滤液。动物细胞，易破碎，鸡血细胞溶液：加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液。蒸馏水对鸡血细胞来说是一种低渗透性的液体。水大量进入血细胞，导致血细胞膨胀和破裂。加入搅拌作用，加速鸡血液细胞膜、核膜破裂，从而释放出脱氧核糖核酸。对于植物细胞，需要溶解细胞膜。加入一定的洗涤剂和盐。充分搅拌研磨。过滤后，收集研磨液。去污剂离子去污剂能溶解细胞膜，有利于DNA释放盐氯化钠和DNA溶解在研磨液中。研磨不充分，细胞核中的脱氧核糖核酸释放不完全，提取的脱氧核糖核酸量少，导致无丝状沉淀，二苯胺鉴定无蓝色等。为了纯化提取的DNA，应该进一步处理滤液。讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？可能含有核蛋白、多糖、核糖核酸和其他杂质，1。脱氧核糖核酸的溶解度，2。DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性，(3)从滤液中除去杂质，用蛋白酶分解杂质蛋白质，并从蛋白质中分离提取的DNA；蛋白质变性是利用DNA和蛋白质对高温耐受性的差异从DNA中分离出来的。为什么可以通过反复溶解和沉淀脱氧核糖核酸来去除杂质？(4) DNA沉淀和鉴定：放置2-3分钟后，与滤液体积相同的冷却酒精溶液(95%体积)将在溶液中出现白色细丝。粗脱氧核糖核酸提取，1。脱氧核糖核酸沉淀，用玻璃棒向一个方向搅拌，(以促进脱氧核糖核酸分子的粘附和缠绕)卷起细丝，并用滤纸吸收上面的水分。脱氧核糖核酸的鉴定，(1)向两个试管中加入5毫升2毫升/毫升的脱氧核糖核酸溶液，(2)向其中一个试管中加入脱氧核糖核酸细丝，(3)向每个试管中加入4毫升二苯胺试剂，(4)混合均匀后，在沸水浴中加热5分钟，(5)冷却后，比较两个试管中溶液的颜色变化，观察现象：溶解细丝的溶液变成蓝色，观察提取的脱氧核糖核酸的颜色，如果不是白色细丝，则表明脱氧核糖核酸中有更多的杂质；二苯胺鉴定中出现蓝色，表明实验基本成功。如果没有出现蓝色，提取的DNA含量可能很低，或者在实验操作中有错误，需要重新准备。1.请解释实验操作中提取DNA的主要步骤的目的。(1)材料选择的目的是选择高DNA含量的生物材料，否则会因实验过程中或多或少的损失而导致检测困难；(DNA的释放和溶解是实验成功的关键。细胞中的所有DNA都应该尽可能地溶解。(3)脱氧核糖核酸纯化，根据脱氧核糖核酸的溶解、耐酶和耐高温等特性，最大限度地将脱氧核糖核酸从杂质中分离出来。(4) DNA鉴定，即对整个实验结果的检测。有“三次过滤，两次沉淀，七次搅拌”。加入“两倍蒸馏水、三倍氯化钠溶液和一倍酒精”。2.你认为从细胞中提取特定蛋白质和提取DNA一样容易吗？提取蛋白质比提取DNA更难。(1)与脱氧核糖核酸相比，蛋白质对温度、盐浓度、酸碱度等条件更为敏感，容易失活；(2)蛋白质的空间结构多种多样，物理化学性质也各不相同，这就使得蛋白质的提取没有统一的方法。只有根据特定蛋白质的特性，才能探索提取条件，设计特定的方法。主题2通过聚合酶链反应扩增DNA片段，1。基础知识，(1)DNA分子的结构，碳，氢，氧，氮，磷，1，组成元素，脱氧核糖核苷酸，2，基本单位，3，脱氧核糖核苷酸结构，聚氧核糖核苷酸链结构示意图，(2)DNA的复制，2，周期，第一次有丝分裂减数分裂前的间隔，3，位点，细胞核(主)，线粒体，叶绿体，4，模板，DNA母链，1，概念，由一个DNA形成两个相同的DNA的过程，5，原料，脱氧核苷酸，6，基础条件，酶，三磷酸腺苷，原料8、遵循碱基互补配对原则，9、复制的意义，以便遗传信息从父母传给后代，从而保持遗传信息的连续性。 (3)聚合酶链反应。1.DNA聚合酶不能从零开始合成DNA，但只能从DNA的3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。2.DNA聚合酶作用过程。当引物和DNA母链通过碱基互补配对结合时，DNA聚合酶可以从引物的3端延伸出DNA链。DNA合成方向总是从亚链的5端延伸到3端。3.聚合酶链反应原理。1.在80-100的温度范围内，脱氧核糖核酸的双螺旋结构会分解，双链会分离。(2)当温度缓慢下降时，相互分离的两条DNA链将重组成双链。聚合酶链反应利用DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚和结合。利用聚合酶链反应技术扩增目的基因。聚合酶链反应实验操作，1。聚合酶链反应仪器，(1)设备和器具，本质上是一种能够自动调节和控制温度的仪器，2。微量离心管，一种薄壁塑料管，总体积为0.5毫升，3。微量移液器，用于定量转移聚合酶链反应公式中的液体。一次性移液器吸头一次更换一次。1.基础知识。蛋白质提取和分离的基础是：蛋白质的理化性质、形状、大小、电荷性质和数量、溶解度、吸附性质、亲和力等。有成千上万的差异。血红蛋白的提取和分离，1。凝胶色谱法，(1)原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的缝隙，行程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路途遥远，流动缓慢。(2) :多孔多糖化合物，如葡聚糖和琼脂糖。(3)分离过程，洗脱：从色谱柱上端连续注入缓冲液，促进蛋白质分子的差异流动。它由弱酸和相应的强碱及弱酸盐组成。例如，h2co 3/碳酸氢钠、磷酸氢钠/磷酸氢二钠等。(4)缓冲液-洗脱液组成：制备：功能：调节酸和盐的用量，可以制备不同酸碱度的缓冲液。抵抗外界酸碱对溶液酸碱度的干扰，保持酸碱度稳定。2.凝胶电泳法：1)原理：不同的蛋白质颗粒具有不同的带电特性(正电荷或负电荷)、电荷量、形状和大小以及d为什么蛋白质带电荷？在一定的酸碱度下，蛋白质的可电离基团将带电，、2)电场作用下蛋白质分子运动的影响因素，3)方法：a。琼脂糖凝胶电泳(如检测聚合酶链反应产物)聚丙烯酰胺凝胶电泳(测量蛋白质分子量的方法)聚苯乙烯凝胶电泳(如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳“蛋白质-十二烷基硫酸钠复合物”)，因此蛋白质的迁移率仅取决于分子大小。(2)实验操作、血液成分、阅读和思考：血液由两部分组成。血细胞中_ _ _ _ _ _细胞数量最多，细胞中含量最高的化合物是_ _ _ _ _ _。血红蛋白由_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _和_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _(4条肽链)组成，每条肽链环绕一个能够结合O2和CO2的_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _基团。红细胞洗涤，100毫升血液，重复洗涤3次，直至上清液不呈黄色。目的：洗掉血浆蛋白，3。分离血红蛋白、红细胞混合溶液、烧杯、有机溶剂血红蛋白、2。释放血红蛋白。运行目的分析：蒸馏水作为_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _。添加甲苯的效果是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _。充分搅拌的目的是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _。使大量红细胞吸收水分，膨胀和破裂，溶解红细胞的细胞膜，加速红细胞的破裂，4。透析血红蛋白，透析目的：去除血红蛋白中的小分子杂质，纯化-凝胶色谱洗脱，1。凝胶色谱柱的制造。凝胶色谱柱的包装：图5-19显示了橡胶塞的制造，3。样品的添加和洗脱，纯化-凝胶色谱操作，1。凝胶色谱柱的制造。凝胶色谱柱的包装：教科书图5-19和3。样品的加入和洗脱，纯度鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，立即用磷酸缓冲液洗涤12小时，洗涤至平衡，一次缓慢倒出；轻轻敲击，装入悬浮液，凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀，根据色谱柱体积计算凝胶用量，将色谱柱垂直固定在支架上，制备悬浮液，计算称取凝胶，固定色谱柱，材料：交联葡聚糖凝胶G-7520mol/L磷酸缓冲液“G”是什么意思？75是什么意思？注意：色谱柱中不应有气泡。装载后，立即用缓冲溶液清洗。