生物工艺课件

第二章生物生产材料的选育,生物生产材料的来源生物生产材料的选育生物生产材料的保藏,2.1生物材料的来源2.1.1生物物质产生菌的筛选2.1.2微生物选择性分离的原理与发展2.1.3重要工业微生物的分离,生物活性物质包括微生物的初级代谢产物，如氨基酸、维生素等，还有微生物的次级代谢产物，如抗生素等。要获得所需生物特性的新产物，关键是解决两个问题：1）微生物的选择2）采用的筛选方案选择性和灵敏度,2.1.1生物物质产生菌的筛选,2.1.2微生物选择性分离的原理与发展,选择性分离的大致步骤：1）含微生物材料的选择2）材料的预处理3）所需生物材料的分离4）生物材料的培养5）生物材料的选择和纯化,1）含微生物材料的选择,原则：材料的来源越广泛，越有可能获得新的生物材料。特别是一些极端环境（高温、高压、高盐、高pH及海洋）中生存的生物类群是重要的生物资源，对其开发利用很有意义。,土壤是微生物聚集最丰富的场所，其组成、有机物浓度、pH等条件影响微生物的种群分布。菜园和农田耕作层：细菌和放线菌果园树根土壤：酵母菌动物和植物残骸及腐殖土：霉菌豆科植物根系土壤：根瘤菌,（提高生物材料分离的效率）热处理：减少材料中的细菌数和放线菌数目膜过滤和离心：浓缩水中的细胞诱饵技术：将石蜡棒、花粉、蛇皮和毛发等固体物质加在待分离的土壤或水中,2）材料的预处理,3）所需生物材料的分离,分离效率取决于分离培养基的养分、pH和加入的选择性抑制剂。,几丁质、淀粉-酪素和M3琼脂是广泛应用的三种选择性分离培养基放线菌的分离培养基pH通常在6.77.5之间。抗生素被广泛用于分离培养基，以增加选择性。如筛选放线菌时，可加入抗真菌抗生素。,4）生物材料的培养,培养温度培养时间,5）生物材料的选择,！最耗时间的阶段根据筛选的最终目的，采用不同的选择菌落方式。显微镜分离某一属的放线菌筛选大量菌落时：铺菌法：在分离平板上铺一层单一的试验菌，测定各个菌落的抗生素生产能力复印平板法：将菌落复印在平板上，考察它们对一系列试验菌的作用。,2.1.3重要工业微生物的分离,筛选具有潜在工业应用价值的微生物：分离筛选,从生物材料保藏委员会索取生物材料或从土壤环境开始分离,分离获得纯的或混合的培养物，接着筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的生物材料。,筛选时需考虑的重要指标：菌的营养特征：采用廉价培养基或来源丰富的原料菌的生长温度：40，降低冷却成本菌的适应性菌的稳定性菌的产物得率和产物在培养液中的浓度产物是否容易回收,根据分离的生物材料不同：设计一种在分离阶段便能识别所需生物材料的方法先用特定的方法分离，随后再去识别所需菌株,对于从自然界获得的微生物混杂物标本，可通过富集培养增加待分离菌的数量。不同种类微生物对环境和营养，如T、pH、O2、渗透压和碳源等有不同的要求，因此人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他微生物生存，从而使目的生物材料占优势。,1）施加选择性压力分离法,控制O2区分好氧和厌氧微生物高T嗜热微生物和非嗜热微生物控制pH嗜酸微生物或嗜碱微生物高糖或高盐耐高渗透压的微生物抗生素或试剂增加选择性,培养方法分批式富集培养（摇瓶培养）重复转种固体培养基连续富集培养改变限制性基质浓度，控制两类不同菌株的比生长速率，获得所需要的生物材料。该法分离出的生物材料，特别适合用于连续发酵生产，还可用于分离适应某种工业生产需要特性的菌株，也可筛选出能共生的稳定混合菌群。,固体培养基：分离各种酶产生菌，如蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、淀粉酶、纤维素酶等酶产生菌都可用这个方法进行筛选选择培养基中常含有所需的基质，以便促使酶产生菌的生长。清晰圈的大小可作为生物材料初筛的判断标准。,举例,用不同pH的土壤作为初始种子，分离获得碱性蛋白酶产生菌。土壤先经巴氏法消毒（？），以减少不产孢子的微生物。然后铺在pH910的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面。碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白，产生一清晰圈。,2）随机分离法,A.抗生素产生菌的分离,把潜在的产生菌生长在含有试验菌的平板上可以鉴定产生菌的抗微生物作用。将微生物分离株生长在液体培养基中，检测其无细胞滤液的抗菌活性。,关键问题：高灵敏度的试验菌专一性很强的筛选技术,B.酶抑制剂产生菌的分离,原理：如果某种化合物能在体外抑制某种关键的人体酶，它就可能在体内具有药理作用。靶酶：与生理和病理关系明确的酶,C.生长因子产生菌的分离,方法：观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长,D.多糖产生菌的分离,制糖工业、食品加工厂等污水中，可能含有较多的多糖产生菌观察菌落外观：一般比较粘稠,2.2生物生产材料的选育,经自然界分离、筛选获得的有价值的生物生产材料，在用于工业生产之前必须经人工选育以得到具一定生产能力的生物生产材料。发酵工业的决定因素就是优良生物生产材料的获得。,2.2.1自然选育2.2.2诱变育种2.2.3杂交育种2.2.4原生质体融合技术2.2.5DNA重组技术2.2.6抗噬菌体菌株的选育,优良生物材料选育的意义：为生产提供了各种类型的突变株，大大提高了生物材料产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物另外，通过生物材料选育可以研究生物材料的分子生物学和分子遗传学,经典育种方法：自然选育、诱变育种较定向的育种方法：杂交育种、原生质体融合、基因工程,优良生物材料选育的技术手段：,2.2.1自然选育,在生产过程中，不经过人工处理，利用生物材料的自然突变进行生物材料筛选的过程叫做自然选育。,自然突变：某些微生物在没有人工参与下所发生的突变,原因：多因素低剂量的诱变效应互变异构效应（据统计，碱基对发生自然突变的几率约为10-810-9)结果：生物材料退化对生产有益,优点：简单易行，纯化生物材料，防止生物材料退化，稳定生产，提高产量缺点：效率低，进展慢自然选育（自然分离）的一般程序：制备菌悬液分离单菌落（稀释法）测定单菌落生产能力,自然选育,2.2.2诱变育种,发酵工业的优良生物材料的选育主要采用诱变育种方法。,1）诱变育种的原理,突变,染色体畸变：染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等,基因突变：DNA中的碱基发生变化，即点突变,诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素有物理的、化学的和生物的三大类。,2）诱变育种的一般步骤,出发菌株培养液细胞或孢子悬液诱变处理平板分离初筛复筛,保藏及扩大试验,纯化、同步培养,离心收集细胞，洗涤，制菌悬液，玻璃珠打散，过滤,活菌计数，诱变预备试验,存活细胞计数，致死率计算,变异率计算,诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重复，直到获得比较理想的高产菌株。诱发突变是使用诱变剂促使生物材料发生突变，所以诱发所形成的突变与生物材料本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量的选择和合理使用方法均有密切关系，这三者是诱变部分的关键所在。,3）诱变中的关键问题,a）出发菌株的选择（野生菌或变异菌）具有一定的目标产物的生产能力；对诱变剂敏感；生长繁殖快、营养要求低、产孢子多且早等,b）诱变剂的种类,常用的物理、化学诱变剂,UV：260nm(253265nm)，15W，30cm；菌悬液；形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性快中子：0.2-10百万电子伏特；菌悬液或平板菌落氮芥：易挥发的油状物，盐酸盐是白色粉末；芥子气（NaHCO3)染色体畸变；青霉素产生菌的选育亚硝酸：脱去碱基中的氨基，及引起DNA两条链交联；很不稳定N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）：诱发营养缺陷型突变“超诱变剂”300g/mL，28，60min,一种新的诱变育种方法,航天育种：利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特点，在宇宙射线辐射的作用下，使生物的遗传性状发生变异，从而选育出优良生物材料。植物种子的航天育种利用航天育种技术对微生物进行遗传育种在国内刚刚起步,c）诱变剂的使用方法,野生菌株单一诱变剂处理多次诱变处理的老生物材料复合诱变剂处理（用两种以上的诱变剂处理生物材料。包括同一诱变剂多次处理，多种诱变剂先后分别处理或同时处理或多次处理。）如：青霉菌的选育中，先以氮芥处理很短时间，再用UV处理，可大大提高诱变频率,d）诱变剂的剂量,诱变剂的剂量致死率诱变率凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适的剂量。要经过多次摸索，从工作中积累经验，才能找到最适诱变因素和剂量。,e)突变菌株的筛选,诱变处理后，正向突变的菌株通常为少数，须进行大量的筛选才能获得高产菌株。挑选菌株一般应从菌落形态、变异类型着手，寻找与产量有关的特性，以确定各种类型与产量之间的关系，从而提高筛选效率。另外，配合采用合适的筛选条件。,2.2.3杂交育种,杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。,获得优良性状集中的重组体克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷扩大变异范围，改变产品产量和质量，甚至创造出新品种,目的,要求,直接亲本（杂交育种所使用的配对菌株）菌株应具有适当的遗传标记，如颜色、营养缺陷标记或抗药性等,金霉素、新霉素、红霉素和新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种,青霉素产生菌的杂交育种（1978年）灰黄霉素产生菌的杂交育种（20世纪60年代）,有哪些成功应用？,2.2.4原生质体融合技术,20世纪70年代后期，将原生质体融合（protoplastfusion)应用于微生物，打破了不能充分利用遗传重组的局面，开始为发酵工业所重视。,迄今为止，发现有杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物则更少，而且即使发生杂交，遗传重组的频率也不高，这就妨碍了基因重组在微生物育种中的应用。,什么是原生质体融合,把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质体）。两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。,1）原生质体融合的优点（一）,遗传物质交换没有细胞壁的障碍，两套基因组得以直接接触、交换，实现基因重组，不需要有已知的遗传系统。即使是相同接合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，并可对原生质体进行转化和转染。亲株基因组之间的多次交换可产生多种类型的重组子，且参与融合的亲株数可多至三个、四个,重组频率高可以和其他育种技术相结合，得到包含多种优良性状的生物材料可采用温度、药物、UV等处理方法钝化亲株的一方或双方，然后使之融合，可以提高筛选效率,1）原生质体融合的优点（二）,2）原生质体融合的一般步骤,制备原生质体原生质体融合原生质体再生筛选融合子,第一阶段：原生质体的制备,G+（枯草杆菌、巨大芽孢杆菌）溶菌酶G-EDTA+溶菌酶，甘氨酸-溶菌酶-EDTA，在含青霉素培养基中培养链霉菌先在含甘氨酸的培养基中培养，再用溶菌酶消化酵母首先接种在巯基乙醇和EDTA的溶液中培养，再用细胞壁溶解酶消化,酶解细胞壁,第二阶段：原生质体的融合和再生,融合,化学因子诱导：PEG4000、6000电场诱导,再生,涂布在高渗培养基上，可增加渗透压或添加蔗糖来增加再生率,第三阶段：融合子的检出,遗传标记互补：选择性培养基荧光染色,3）在微生物育种中的应用,之一、获得高产优质菌株经过原生质体化与再生过程：可能得到产量提高的细菌和链霉菌的变异菌株；链霉菌细胞内质粒消除的结果常导致细胞染色体的改变，或使次级代谢途径发生变化，有可能出现有利于提高抗生素产量的变异菌株（如白霉素、金丝霉素）。种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。,之二、诱发“沉默基因”的表达，产生新的产物,3）在微生物育种中的应用,有效的种间融合，有可能使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发一些原来为“沉默基因”的表达，从而产生新物质。,2.2.5DNA重组技术,按人的意志，将某一生物体（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使被引进的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。,基因工程,1）DNA重组技术的含义（DNArecombinationtechnology),2）DNA重组技术的基本路线,基因重组能使人们在基因水平上对生物进行有效的控制，在工业、医药和人类疾病的控制等方面有巨大的应用价值。随着重组DNA技术的发展，将高等生物的基因克隆到大肠杆菌中，由大肠杆菌发酵生产人胰岛素、人生长激素和干扰素等高附加值药物产品已经工业化。DNA重组技术在生物材料选育方面开创了一个新领域。,分子育种（MolecularBreeding),利用基因工程技术、原理和设备，在分子水平上改良生物材料。,主要体现在：增加生物合成基因量而增加抗生素产量导入强启动子或抗性基因而增加抗生素产量经体外重组产生杂交抗生素激活沉默基因，产生新的生物活性物质,对工业生产有重要意义的是：基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物活性和产物的分离纯化。因此，进行基因表达设计时，必须考虑各种影响因素，选择最佳的基因表达系统。,3）基因工程菌的稳定性,研究发现，工程菌在保存及发酵生产过程中表现出不稳定性，结果是得不到预期的目的基因的产物或产量很低。解决工程菌的稳定性问题，已日益受到重视，并成为基因工程技术成就转变为生产力的关键问题之一。,工程菌不稳定性的表现,质粒的不稳定分裂不稳定（质粒丢失）环境或生理、遗传学的原因结构不稳定（重组质粒的DNA片段脱落）质粒变小或某些遗传信息变化甚至丢失（在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率往往小于不含重组质粒的菌株的比生长速率）表达产物的不稳定：人干扰素工程菌随着培养时间的延长，干扰素活性下降,解决工程菌不稳定性的对策（一）,.组建合适载体：在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因以增加传代时的质粒稳定性.选择适当宿主：重组质粒在大肠杆菌中相比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。（重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响。）,.施加选择压力（阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长，从而消除发酵生产过程中重组质粒的不稳定）a)抗生素添加法b)抗生素依赖变异法c)营养缺陷型法,解决工程菌不稳定性的对策（二）,.控制基因过量表达研究发现，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。两阶段培养法诱导性启动子,解决工程菌不稳定性的对策（三）,.控制培养条件克隆菌所处的环境条件对其质粒的稳定性和表达效率影响机制错综复杂，而众多的环境因素中，培养基组成、培养温度和菌体的比生长速率三方面尤其重要。.对宿主细胞生长速率进行改良（质粒构建时实现）.避免所使用的质粒中带有可转移因子.尽量除去质粒上不需要的DNA部分.固定化,解决工程菌不稳定性的对策（四）,2.2.6抗噬菌体菌株的选育,什么是噬菌体？,噬菌体(phage)是一种感染细菌或放线菌的病毒。,噬菌体有两类：,烈性噬菌体：感染宿主细胞后，立即引起细胞裂解温和性噬菌体：感染细胞后，并不马上引起细胞裂解，而是以“原噬菌体”方式整合在宿主的DNA中，随寄主繁殖而延续传代。,带有原噬菌体的菌株称为溶原性菌株。,原噬菌体不同于营养期的噬菌体，它没有感染性，对宿主一般无不良影响，但是：,溶原性菌株具有产生噬菌体的潜在能力：溶原性菌株培养时，少数会自发脱离染色体，导致细菌裂解。而在某些物理化学因素（UV，X射线，氮芥等）刺激下，原噬菌体会脱离染色体，开始复制，从而导致溶原性菌株裂解，产生大量的噬菌体。对同一类型噬菌体具有免疫性：溶原性菌株对其本身产生的噬菌体或外来的同源噬菌体不敏感，这些噬菌体虽然可以进入溶原性菌株，但不能增殖，也不能导致溶原性菌株裂解。,1）噬菌体的危害,目前发酵工业中噬菌体的危害是一个普遍的问题，凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题，如抗生素、味精和酿酒发酵经常会遭受噬菌体污染。出现噬菌体污染后，往往出现一些明显的异常现象，如碳源和氮源的消耗减慢，发酵周期延长，pH值异常变化，出现畸形菌丝，菌体裂解和减少，引起光密度降低和产物锐减等。污染严重时，无法继续发酵，应将整罐发酵液报废（即倒罐）。,噬菌体分布广泛，存在于土壤、肥料、粪便和污水等自然环境中，也可在受细菌病害的植株上，工厂下水道的污水中和四周土壤中发现噬菌体，甚至空气中也能分离到噬菌体。防治噬菌体，应以预防为主，同时采取筛选抗性菌株与保持环境卫生，杜绝噬菌体的滋生，两者结合，才是有效的防治措施。,2）抗噬菌体菌株的选育（一）选育方法,研究表明，细菌的抗性是基因突变的结果，在接触噬菌体之前就可发生抗噬菌体突变。,a)自然突变（抗性突变频率很低）以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自然突变为抗性菌株。b)诱发突变敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度噬菌体的平板培养基上，经诱变后的存活孢子中，若存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。,方法：,抗噬菌体菌株的特性试验：a)稳定性试验：孢子培养、种子培养和发酵培养过程中测定噬菌斑；经多次传代后抗性菌株的抗性是否稳定b)产量试验：要求抗性菌株生产能力不低于原敏感菌株,2）抗噬菌体菌株的选育（二）特性试验,选育的抗性菌株在用于生产之前，需经过反复验证。,溶源性菌株对同一类型噬菌体具有免疫性，表面上看来，这种菌株具有抗性，但若用于发酵生产存在潜在的危险，一旦溶原性菌株发生自发裂解或诱发裂解，将会危害发酵菌株，给发酵生产带来经济损失。因此必须采取有效的手段检测出溶原性菌株。溶原性菌株的检测：常用敏感的、非溶原性的菌株作为指示菌。将待测菌样在合适的培养基中培养，并在生长的对数期进行UV照射，诱导原噬菌体复制。经进一步培养后，将培养物过滤，去除活菌体，将滤液与指示菌混合后倒平皿，观察是否有噬菌斑出现。也可将滤液加到指示菌的液体培养物中，观察是否能使菌液变清。如果有噬菌斑出现或使菌液变清，则说明被测菌株是溶源性菌株。,c)真正抗性与溶源性的区别试验,2.3.1生物生产材料保藏的重要意义2.3.2生物生产材料保藏的原理2.3.3生物生产材料保藏的方法2.3.4国内外主要生物材料保藏机构,2.3生物生产材料的保藏,2.3.1生物材料保藏的重要意义,生物材料是一个国家的重要自然资源，世界各国对这项资源都给予了极大重视。生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失称为生物材料退化。退化是生物材料自发突变的结果。优良的生物材料来之不易，在科研和生产中应设法减少生物材料的退化和死亡。,如何保证生物材料经过较长时间后，仍保持其优良性状的稳定？生物材料保藏的研究课题,生物材料保藏的重要意义就在于保持优良生物材料的优良性状，满足今后长期生产和科研的实际需要。,2.3.2生物材料保藏的原理,选用优良的纯种，最好是休眠体（分生孢子、芽孢等），创造一个使微生物代谢不活泼，生长繁殖受抑制，难以突变的环境条件。,环境要素,干燥、低温、缺氧、缺营养、添加保护剂等,2.3.3生物材料保藏的方法,长期保持生物材料原有的优良性状不改变简便、经济，便于推广,1)斜面保藏法和穿刺保藏法,短期保藏法，4冰箱，36个月最早使用且至今仍普遍采用的方法优点：简单易行，可随时观察缺点：保藏时间短，生物材料易退化（用无菌橡皮塞或螺旋口试管代替棉塞，减少污染和培养基失水，延长保藏期）,斜面保藏法,穿刺保藏法常用于好气性细菌的保藏1%软琼脂培养基，用接种针将生物材料穿刺接入培养基的1/2处覆盖23mm无菌液体石蜡冰箱，612个月,2)沙土管干燥保藏法,载体：沙、土、沙+土干燥、寡营养适用于形成芽孢的细菌、产生孢子的丝状真菌和放线菌。,3)液体石蜡保藏法,在生长良好的斜面表面覆盖一层无菌液体石蜡，液面高出斜面1cm。直立放置延长保藏时间,4)真空冷冻干燥保藏法,各保藏机构