高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用).ppt

高效液相色谱仪使用与操作规程,Agilent1100HPLC,第一步,第二步,第三步,第四步,准备,开机,注意事项,清洁关机,步骤,Agilent1100系统组成,本系统由溶剂输送泵（四元泵，标配真空脱气机）Rheodyne7725i手动进样阀柱温箱VWD紫外-可见检测器Agilent1100色谱数据工作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。,第一步、准备,1、准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜过滤，超声脱气20min。2、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。3、配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45m滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）4、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。,接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。,第二步、开机,一）参数设定,1、波长设定：2、流速设定：3、流动相比例设定：4、梯度设定：,二）更换流动相并排气泡,1：将吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；2：顺时针转动泵的排液阀180，打开排液阀；3：运行泵，泵以3ml/min的流速冲洗5min（可设定）后泵流速设为0ml/min；4：将排液阀逆时针旋转适度拧紧，关闭排液阀。5：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。,三）平衡系统,用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操作。观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为25mmol/L的缓冲液4.每天冲洗柱5.稳定进样条件,调节流动相6.采用保护柱,二、保留时间缩短,1.流速增加2.样品超载3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度增加,1.检查泵,重新设定流速2.降低样品量3.流动相PH值保持在37.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温,三、保留时间延长,1.流速下降2.硅胶柱上活性点变化3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度降低,1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.流动相PH值保持在37.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温,四、出现肩峰或分叉,1.样品体积过大2.样品溶剂过强3.柱塌陷或形成短路通道4.柱内烧结不锈钢失效5.进样器损坏,1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.采用较弱的样品溶剂3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.更换进样器转子,五、鬼峰,1.进样阀残余峰2.样品中未知物3.柱未平衡4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)5.水污染(反相),1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.处理样品3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.每天新配,用抗氧化剂5.通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水,六、基线噪声,1.气泡(尖锐峰)2.污染(随机噪声)3.检测器灯连续噪声4.电干扰(偶然噪声)5.检测器中有气泡,1.流动相脱气,加柱后背压2.清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.更换氘灯4.采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.流动相脱气,加柱后背压,七、峰拖尾,1.柱超载2.峰干扰3.硅羟基作用4.柱内烧结不锈钢失效5.柱塌陷或形成短路通道6.死体积或柱外体积过大7.柱效下降,1.降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.清洁样品,调整流动相3.加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件6.连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱,八、峰展宽,1.进样体积过大2.在进样阀中造成峰扩展3.数据系统采样速率太慢4.检测器时间常数过大,1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.进样前后排出气泡以降低扩散3.设定速率应是每峰大于10点4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%,八、峰展宽,5.流动相粘度过高6.检测池体积过大7.保留时间过长8.柱外体积过大9.样品过载,5.增加柱温,采用低粘度流动相6.用小体积池,卸下热交换器7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8