吴怡慧-项目二超氧化物歧化酶(SOD)的生产详解PPT课件

.,1,项目二超氧化物歧化酶（SOD）的生产,班级：生物制药1411姓名：吴怡慧,预习方案汇报PPT,.,2,酶与SDO酶的基本知识,1,酶的生产工艺与准备,2,SOD酶的检验与准备,3,注意事项,4,Contents,目,录,.,3,第,一,章,节,di,yi,zhang,jie,2、超氧化物歧化酶（SOD）基本知识,1、酶的基本知识,.,4,酶的基本知识,酶是由生物活细胞产生的具有特殊催化功能的一类生物活性物质，其化学本质是蛋白质，故也称酶蛋白。用于预防，治疗和诊断疾病的一类酶制剂，称为药用酶。早期主要用于治疗消化道疾病、烧伤及感染引起的炎症等，现已广泛应用于多种疾病的治疗。药用酶制备通常有三种方法：直接提取法；微生物发酵法；动植物细胞培养法药用酶常用提取纯化方法有：水溶液法；有机溶剂法；表面活性剂法（应用较少）,.,5,超氧化物歧化酶（SOD）基本知识,概念：超氧物歧化酶（SuperoxideDismutase简称SOD）是一种新型酶制剂，是广泛存在于生体内各种组织的一种金属酶，是机体细胞抵御氧化损伤最重要的酶之一，是药用酶之一，被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。功能：清除体内多余的自由基；延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象；提高人体抵抗自由基诱发疾病的能力；能抗疲劳、甚至抗肿瘤体内的SOD活性越高，寿命就越长。分布：,主要来源：大蒜蒜瓣（含有丰富的SOD酶）,.,6,第,二,章,节,di,er,zhang,jie,2、实训准备（材料与仪器),3、酶的生产工艺流程图,1、SOD酶的提取原理,.,7,SOD酶的提取原理,有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。,超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。,.,8,实训准备（材料与仪器）,材料：大蒜蒜瓣氯仿-乙醇混合液冷丙酮磷酸缓冲溶液（PH7.8、0.05mol/L),仪器：一个石英砂研钵离心管移液管玻璃棒塞离心管离心机冷冻离心机,.,9,SOD酶的生产工艺流程图,称取5g大蒜蒜瓣,捣碎,加入磷酸缓冲溶液15ml(PH7.80.05mol/L),再研磨20min直到充分溶解,置于冷冻离心机以6000r/min离心15min,弃沉淀取上清,提取,于上清液中加入1/4倍体积氯仿-乙醇混合液,搅拌15min,以6000r/min离心15min,弃沉淀取上清,得到粗酶液,加入等体积冷丙酮,持续搅拌15min以6000r/min离心15min,得到SOD酶沉淀,冷冻干燥,将沉淀置于5ml磷酸缓冲溶液中（PH7.8、0.05mol/ml）,以6000r/min离心15min,弃沉淀取上清液,用凝胶SephacrylS-200进行纯化,进行超滤浓缩得到SOD酶,除杂蛋白,分离,纯化,.,10,第,三,章,节,di,san,zhang,jie,2、实训准备（材料、仪器）,1、SOD酶检验的原理,3、SOD酶检验步骤,.,11,SOD酶检验原理,连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色的中间产物（反应液由黄棕色变为绿色，再变为黄色，这是由于生成的中间物不断氧化的结果）。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30-45s后就与时间呈现性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，线性时间一般维持4min的范围内。在有SOD存在时能催化生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。邻苯三酚自养化法测定酶活力，计算公式：单位体积活力（u/ml）=总活力（U）=单位体积活力x原液总体积酶活力单位意义：在25恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。,0.070-供试品溶液速率,0.070,50%,x,反应液总体积,x,供试品溶液稀释倍数,供试品溶液体积,x,100%,.,12,SOD酶检验准备,试剂：（1）PH8.3050mol/LK2PHO4-KH2PO4缓冲溶液：25下96.5ml1mol/LK2HPO4与3.5ml1mol/LKH2PO4混合后用水稀释至2000ml（2）0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500ml（3）10mol/L盐酸溶液,仪器：（1）PH计（2）紫外分光光度计（3）恒温水浴槽（4）10ml试管（5）1cm比色皿,.,13,SOD酶检验步骤,一、连苯三酚自养化速率的测定（1）准备好两只试管，同时加入PH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液4.50ml，在25+-0.5的恒温水浴中保温10min；（2）其中一只试管加入等体积事先预热好的25连苯三酚溶液，另支试管作为空白管，加入等体积10mol/LHCl，迅速摇匀后倒入1cm比色皿中；（3）以空白管为参比，在325nm下每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节连苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在0.068-0.072D/min。经实验测得连苯三酚溶液的用量为6ul,.,14,SOD酶检验步骤,二、酶活性的测定（1）取两支试管时加入PH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液1.5ml，在25+-0.5的恒温水浴中保温10min，加入等体积酶液；（2）取一支加入事先预热好的25连苯三酚溶液，另支空白试管再加入10mol/LHCl，迅速摇匀后倒入1cm比色皿中；（3）以空白管为参比，在325nm下每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节酶液体积，,使样液中连苯三酚的氧化速度控制在0.033-0.037D/min，记录此时样液体积。（4）根据公式计算出酶活性。,.,15,第,四,章,节,di,si,zhang,jie,1、注意事项2、参考文献,.,16,注意事项,（1）在破碎细胞时要注