微生物群落结构分析方法根据微生物利用碳源特性.ppt

膜磷脂脂肪酸图谱分析(PhospholipidFattyAcidProfile)代谢指纹技术(群落水平生理特征图谱Biolog)Metabolicfingerprintingtechniques-Communitylevelphysiologicalprofiles(CLPPs),微生物群落结构分析,膜磷脂脂肪酸分析,微生物特异磷脂脂肪酸,脂肪酸分子通式：X:YZ（c/t）X：脂肪酸分子的总碳原子数；Y：烯键的数目；：双键的位置（从羧基端起计）;后缀c和t分别表示顺式和反式同分异构体,a(anto):前异构甲基支链;cyc:环丙基支链;i(iso):异构甲基支链;Me:甲基支链,在生物体中的浓度恒定：不随种类、生长条件和生理状态而变化,应用细胞中特异化学成分的前提,该物质仅存在于活的生物体中，在死亡微生物体或非生物的有机物质中量很小,磷脂脂肪酸仅存在于活细胞的细胞膜中，死亡细胞膜磷脂被迅速分解,容易从细胞和土壤中提取出来；有测定该物质灵敏、准确的方法,PLFAs可从土壤中直接提取出来，并用气相色谱测定其总量及种类,特定微生物具有特异性PLFAs，膜磷脂脂肪酸分析反映微生物群体的多样性，可以用来测定微生物量中真菌和细菌比例,在生物体中的浓度恒定：不随种类、生长条件和生理状态而变化,微生物PLFAs组成随环境及生理状态而有所变化,膜磷脂脂肪酸总量与土壤微生物量(SIR法)的相关性,(BthDP:入渗空隙;EC:电导率;AWC:有效水容量;N:氮;OMC:有机质含量；SP：饱和率;PW:孔隙水,土壤微生物群落结构以及物理化学性状受污水灌溉的影响,Wastewatertreatedcontrol,主成份分析土壤加入不同浓度的Hg培养一周后，在31种单独碳源基质上最大显色速率;主成份1和2分别解释总变异的41.1%和17.4。(Mlleretal.,2001.FEMSMicrobiologyLetters,204,49-53),应用实例-微生物群落对土壤中Hg响应,主成份1,主成份2,优点简单、快速，适用于大量样品的测定尤其适合对于根际微生物群落结构的分析局限性只适用于可培养的微生物选择性测定能利用简单基质快速生长的微生物不适于森林土壤常用的Ecoplate平板中碳源物质缺乏纤维素、半纤维素、木质素、几丁质等森林土壤中常见的有机物质,Biolog方法评价,基于16SrDNA分析方法描述群落结构,基于PCR16SrRNA分析,利用荧光染色显微镜镜检发现每克土壤或水体沉积物可含有1010个细菌而利用琼脂板分离到的细菌在森林土壤中仅占0.1-1%，在农田土壤中也不过10%；利用分子生物学技术可以分析包括不可培养的微生物在内的整个土壤微生物群落结构；,rDNA扩增及限制性位点分析(ARDRA),AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis通过PCR扩增、克隆可探测到已知和未知的DNA序列，但每克土中有4000多种微生物，分析每个土壤样本要测序几千个序列，非常耗时，利用ARDRA提取土样中DNA;利用一定的标记引物(如荧光)对样品中的DNA进行特异扩增；然后进行限制性内切酶酶解,获得末端限制性片段TRFs；电泳分离片段，检验TRFs的多样性；利用主成份分析比较不同样本的末端限制性片段的特征,多聚酶链反应-变性或温度梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE/TGGE),Denaturing/TemperatureGradientGelElectrophoresis使用1对特异性引物，利用PCR扩增微生物自然群体的16S/18SrRNA基因;产生长度相同但序列不同的DNA片段的混合物，然后用DGGE分离；所得环境样本的特异性DGGE条带，经切胶，再进行PCR扩增特异性DNA片段直接测序或经DNA克隆、测序；进行系统发育分析，构建遗传相似性图谱，以揭示微生物多样性演变的内在机制,CsCl/ethidiumbromide密度梯度平衡离心法分离同位素标记的DNAa:从利用12C-或13C-methanol作惟一碳源纯培养的M.extorquensAM155提取的DNA；b,c:分离前后从加入12C-or13C-methanol作惟一碳源的土壤中提取出的DNABar:1cm(Radajewskietal.,2000Nature403,646-649),稳定同位素探针技术,从一系列单个基因组序列分析推断它们在环境中相互作用,Kowalchuk,2005,测定特定环境基因组序列,并利用技术和试验设计降低复杂程度,生物多样性指标,Alpha(a)多样性特定区域、群落或生态系统中生物多样性，一般用物种丰富度表示；Shannon指数H=-SPilnPi(i=1toS)S:物种数；Pi=ni/N:第i个物种个体(ni)占全部个体N比例。是communicationentropySimpson指数D=1-SPi2(i=1toS)Pi2=ni(ni-1)/N(N-1);0D1,接近1说明生物多样性高，或环境空间异质性大，而近于0说明多样性小,Beta-diversity=(S1c)+(S2c)S1,S2分别是两个群落的物种数；c在两个群落中都有的物种数，可用来比较生态系统或表征环境梯度的影响；Srensenssimilarityindexb=2c/(S1+S2),参考文献,1)FirestoneM.,BalserT.,HermanD.Definingsoilqualityintermsofmicrobialcommunitystructure.AnnualReportsofResearchProjects,UCBerkeley,19972)GarlandJL.,MillsAL.Classificationandcharacterizationofheterotrophicmicrobialcommunitiesonthebasisofpatternsofcommunitylevelsolecarbonsourceutilization.Appl.EnvironmentMicrobiology,1991,57:2351-23593)GarlandJL.AnalyticalapproachestothecharacterizationofsamplesofmicrobialcommunitiespatternsofpotentialCsourceutilization.soilbiologybiochemistry,1996,28:213224)MullerA.K.,RasmussenL.D.,SrensenS.J.Adaptationofthebacterialcommunitytomercurycontamination.FEMSMicrobiologyLetters2001,204:49-535)Z