降压物质检查法

.,1,降压物质检查法DEPRESSORSUBSTANCES,山东省药品检验所,.,内容提要,基本概念和原理2010年版增修订内容检查法欧洲药典降压物质检查法组胺类物质检查法,.,基本概念和原理,检验目的组胺、缓激肽一类的物质具有血管扩张作用，超过一定剂量会使血压快速降低，对人体产生危害。来自动物或微生物发酵提取物及生产过程中有可能混入此类物质的原料，应建立降压物质检查项，如抗生素、氨基酸、多肽等。来自动植物、微生物发酵提取物及生产过程中有可能混入组胺类或类组胺类物质的注射剂(静脉），应建立降压物质检查项。如抗生素、中药注射剂、氨基酸、多肽类等。,.,基本概念和原理,降压物质检查法定义：本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定本法原理是利用猫对组胺样物质具有较为敏感的作用，通过静脉给予一定剂量的供试品，观察对麻醉猫血压的影响，以判定供试品中降压物质的限度是否符合要求。,.,2010年版增修订情况,历史沿革1985年版药典至现行药典（2005年版）方法基本一致2005年版动物去掉了狗（5kg以上）2010年版修订,.,2010版与2005版区别,.,2010版与2005版区别,.,修订背景,1、强调对照品的降压活性要符合要求2、强调猫的正常血压范围为13.320.0kPa3、强调每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行，而不强调要35分钟之内。,.,检查法-材料,1血压记录装置：生物机能实验系统（多导生理记录仪），相应的传感器，血压计（定标用）2动脉插管（细的硬塑料管）、静脉插管（10号或12号钝针头）、三通等连接装置，可调定量加样器，软管（硅胶管或乳胶管）。31ml、2ml、5ml、10ml注射器（4号半针头），玻璃容器：吸管、容量瓶等4相应精度天平（对照品万分之一）、动物天平（秤）5试剂：供试品、组胺对照品、肝素钠（针剂或原料均可）、苯巴比妥钠注射液、戊巴比妥钠等麻醉剂，生理盐水(氯化钠注射液）6手术器械、保温手术台、固定猫用的绳具等,.,检查法-材料,手术器械：剪毛剪、手术剪、眼科剪、止血钳、手术刀、手术镊、眼科镊（直和弯）、气管插管、动脉夹、脱脂棉、纱布,.,检查法-对照品,对照品溶液的配制精密称取磷酸组胺对照品适量，按组胺计算，加水溶解使成每1ml中含1.0mg的溶液，分装于适宜的容器内，48贮存。经验证保持活性符合要求的条件下，可在3个月内使用。对照品稀释液的配制临用前，精密量取组胺对照品溶液适量，用氯化钠注射液配成每1ml中含组胺0.5ug的溶液。注：1对照品割开勿使玻璃屑调入2折算0.362，1mg磷酸组胺相当于组胺3贮存液用灭菌水配制，保存，使用时取出放置至室温,.,检查法-供试品溶液,供试品溶液的配制按品种项下规定的剂量，配成适当浓度的供试品溶液。试验时，一般要求供试品溶液与对照品稀释液的注入体积应相等。注：供试品溶液与对招品溶液注入体积应相等，一般为0.2ml/kg体重举例：注射用阿齐霉素，标准规定注射量为2000u/kg，则应配成10000u/ml，按0.2ml/kg注射，给药量为2000u/kg供试品和对照品如体积相差过大，可通过补充生理盐水量调整。,.,检查法,取健康合格、体重2kg以上的猫，雌者无孕。用适宜的麻醉剂(如巴比妥类)麻醉后，固定于保温手术台上，分离气管并插入插管以使呼吸畅通，必要时可进行人工呼吸。在一侧颈动脉插入连接测压计的动脉套管，管内充满适宜的抗凝剂溶液，以记录血压。也可用其他适当仪器记录血压。在一侧股静脉内插入静脉插管，供注射药液用。试验中应注意保持动物体温。全部手术完毕后，将测压计调节到与动物血压相当的高度(一般为13.316.0kPa)，开启动脉夹，待血压稳定后，方可进行药液注射。各次注射速度应相同。每次注射后立即注入一定量的氯化钠注射液，相邻两次注射的间隔时间应一致(35分钟)，每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行。,.,动物要求,健康合格，体重2kg以上的猫，雌者无孕。来源：目前可为市售家猫一般在3kg以上为好，麻醉耐受性，血压稳定无孕实验过程中注意保温,.,检查法-麻醉,常用麻醉剂和剂量戊巴比妥钠：静脉注射或腹腔注射3040mg/kg，一般配成3040mg/ml，按每kg体重给药1ml，一次给药可维持麻醉24h，优点为起效快，缺点维持时间短苯巴比妥钠+戊巴比妥钠：（比例不同实验室不同）苯巴比妥钠（1ml：100mg）135mg/kg约2mg/kg戊巴比妥钠（可配成10mg/ml）乌拉坦：静脉注射或腹腔注射11.25g/kg，优点对呼吸抑制小。,.,检查法-仪器连接,颈动脉动脉插管换能器记录仪股静脉静脉插管给药装置,.,检查法-动物灵敏度检查,自静脉依次注入上述对照品稀释液，剂量按动物体重每1kg注射组胺0.05ug、0.1ug及0.15ug，重复23次，如0.1ug剂量所致的血压下降值均不小于2.67kPa，同时相应各剂量所致反应的平均值有差别，可认为该动物的灵敏度符合规定。注：组胺浓度为0.5ug/ml，则给药量为0.1、0.2、0.3ml/kg,.,检查法-供试品检查,取对照品稀释液按动物体重每1kg注射组胺0.1ug的剂量(ds)，供试品溶液按品种项下规定的剂量(dT),照下列次序注射一组4个剂量：ds、dT、dT、ds。然后以第一与第三、第二与第四剂量所致的反应分别比较；如dT致的反应值均不大于ds所致反应值的一半，即认为供试品的降压物质检查符合规定。,.,检查法-复试,否则应按上述次序继续注射一组4个剂量，并按相同方法分别比较两组内各对dS、dT剂最所致的反应值。如dT所致的反应值均不大于dS所致的反应值，仍认为供试品的降压物质检查符合规定；如dT所致的反应值均大于dS所致的反应值，即认为供试品的降压物质检查不符合规定；否则应另取动物复试。如复试的结果仍有dT所致的反应值大于dS所致的反应值，即认为供试品的降压物质检查不符合规定。,.,所用动物经灵敏度检查如仍符合规定，可继续用于降压物质检查。,.,原始记录,组胺对照品溶液及其稀释液的配制供试品溶液的配制实验动物的种类及性别、体重（许可证号）麻醉剂的名称、配制及剂量抗凝剂的名称及用量记录血压仪器名称及型号动物的基础血压、动物灵敏度的测定供试品溶液及对照品稀释液的注入体积测量值与结果判断完整图谱,.,组胺类物质检查法,附录XIXM化学药注射剂安全性检查法应用指导原则化学药注射剂安全性检查包括异常毒性、细菌内毒素（或热原）、降压物质（或组胺物质）、过敏反应等项。根据处方、工艺、用法及用量等设定相应的检查项目并进行适用性研究。,.,4组胺类物质检查本法系将一定浓度的供试品和组胺对照品依次注入离体豚鼠回肠浴槽内，分别观察出现的收缩反应幅度并加以比较，以判定供试品是否符合规定的一种方法。不合格供试品表明含有组胺和类组胺物质。在临床上可能引起血压下降和类似过敏反应等严重的不良反应。检查方法参照本附录“附组胺类物质检查法”,.,设定限值前研究在确定限值前，应考察供试品对组胺对照品引起的离体豚鼠回肠收缩反应的干扰（抑制或增强），求得最大无收缩干扰浓度。若供试品的配方、生产工艺等任何有可能影响试验结果的条件发生改变时，需重新进行干扰试验。,.,干扰试验按组胺类物质检查法，依下列顺序准确注入供试品稀释液与对照品稀释液低剂量、对照品稀释液低剂量、供试品稀释液与对照品稀释液高剂量、对照品稀释液高剂量（dS+T、dS、dSH+T、dSH），重复一次，如dS+T及dSH+T所致的反应值与dS及dSH所致的反应值基本一致，可认为供试品不干扰组胺物质检查；否则该品种不适合设立组胺物质检查项，建议设立降压物质检查项。,.,限值确定除特殊要求外，原则上与降压物质检查限值一致，以临床单次用药剂量的1/55倍量和每公斤体重0.1g组胺剂量计算注射剂含组胺类物质检查限值，其计算公式为：限值L=K/M，其中K值为人每公斤体重接受的组胺量（0.1g/kg），M为降压物质检查限值（mg/kg、ml/kg、IU/kg）。供试品剂量应低于最大无收缩干扰剂量。抗肿瘤药、心血管病药等急重病症用药应采用高限。,.,组胺类物质检查法,定义：本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起豚鼠离体回肠收缩的程度，以判定供试品中所含组胺类物质的限度是否符合规定。,.,对照品溶液的制备,精密称取磷酸组胺对照品适量，按组胺计算，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液，分装于适宜的容器内，48贮存，在确保收缩活性符合要求的前提下，可在3个月内使用。,.,对照品稀释液的制备,试验当日，精密量取组胺对照品溶液适量，用氯化钠注射液按高、低剂量组（dSH、dS）配成两种浓度的稀释液，高剂量dSH应不致使回肠收缩达到极限，低剂量dS所致反应值约为高剂量的一半，调节剂量使可以重复出现。一般组胺高低剂量的终浓度为10-610-8g/ml，注入体积0.21.0ml为宜。,.,供试品溶液的制备,按品种项下规定的限量，照对照品稀释液低剂量（dS）配制成适当的浓度。试验时，一般供试品溶液与对照品稀释液的注入体积应相等。,.,回肠肌营养液的制备,A液：试验当日，取氯化钠160.0g、氯化钾4.0g、氯化钙（按无水物计算）2.0g、氯化镁（按无水物计算）1.0g与磷酸氢二钠（含12个结晶水）0.10g，加注射用水700ml使溶解，再加入注射用水适量，使成1000ml。B液：取硫酸阿托品0.5mg、碳酸氢钠1.0g、葡萄糖（含1个结晶水）0.5g，加适量注射用水使溶解，加A液50.0ml，混合后加注射用水使成1000ml。B液应临用前配制，并在24h内应用。,.,检查法,取健康合格的成年豚鼠，雌雄均可，雌者无孕，体重250350g，禁食24h，迅速处死，将血排净。立即剖腹取出回肠一段（选用远端肠段，该段最敏感），注意避免因牵拉使回肠受损，必要时仔细分离肠系膜。剪取23cm长，用注射器抽取上述溶液B，小心冲洗出肠段的内容物。将肠段下端固定于离体器官恒温水浴装置的浴槽底部，上端用线与肌张力换能器相连；浴槽中事先放入一定量的B液（约1030ml），通入95O2和5CO2的混合气体，维持恒温（3436C），用适当方法记录回肠收缩曲线。如果使用杠杆，其长度应能使肠段的收缩放大约20倍。选择1g的预负荷，可根据其灵敏度加以调节。回肠放入浴槽后，静置1530min，方可开始注入药液。每次注入药液前，要用B液冲洗浴槽3次（最好是溢出，而不排空浴槽）。相邻两次给药的间隔时间应一致（约2min），每次给药前应在前一次反应恢复稳定后进行。,.,取对照品稀释液和供试品溶液，照下列次序准确注入浴槽：dS、dT、dT、dS、dSH，如dSH所致的反应值大于dS所致反应值时判定试验有效。如供试品溶液引起回肠收缩，则分别计算dS、dT所致反应的平均值。若dT所致反应的均值不大于dS所致反应的均值，即判定供试品组胺类物质检查符