《DNA的粗提取和鉴定》实验中的几个常见问题

DNA的粗提取和鉴定实验中的两个常见问题陶晓东（江苏省常州市武进高级中学生物组 213161）摘要：中学实验中提取DNA的实验材料的选择问题，几种实验材料各自的优缺点；DNA鉴定过程中易出现的一些常见问题及具体的解决方案。关键词：鸡血细胞DNA提取液 二苯胺试剂人教版高中生物教材第二册（必修）中的实验十一DNA的粗提取和鉴定是一个比较重要的学生实验。该实验比较复杂，在实际操作过程中需要注意的细节问题也非常多，而且往往因为某个环节的操作不当，结果不能观察到明显的实验现象。因此，有必要对实验过程中应当注意的问题做一些探讨。从我个人和学生的实际实验操作过程中，我认为有以下两个问题值得注意。一、 实验材料的选择问题：虽然各种生物细胞中都含有大量的DNA，但是并不是每一种生物组织都适合做提取DNA的原材料。比较好的实验材料最好应该满足以下几个条件1 组织中DNA的含量比较丰富,能够适合大量提取。2 该组织中所含化合物种类应比较单纯,避免由于其他物质化学性质与DNA相近，从而对实验现象产生某些干扰。3 实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本。4 实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单的条件下能大量提取出DNA，便于学生实验操作。可用于提取DNA的实验材料很多，人教版高中生物第二册教师教学用书中提供了两类可用于提取DNA的实验材料：鸡血和植物组织（新鲜菜花、蒜黄、菠菜等）；另外在实验教学与仪器杂志2002年第一期的探讨“DNA的粗提取与鉴定”的实验改进一文中提供了另一种可行的实验材料：鱼类的精巢；此外，在高教出版社生化实验方法和技术一书中还介绍了一种从动物胸腺中提取DNA的方法，这是一种大学教材上提供的方法。这几种实验材料由于各自性质的差异，实验的操作过程和步骤有很大的差别，以下是四种实验材料特点的粗略比较。实验成本DNA含量特殊药品配置实验仪器配置实验效果鸡血细胞取材易，价格较低丰富柠檬酸钠离心机 可操作性强，实验效果明显植物组织易取材，价格较低较丰富SDSEDTA三羟甲基氨基甲烷常规实验成功率较低，实验效果与研磨液关系密切，鱼类精巢取材易，价格较低丰富无组织捣碎机可操作性强，效果明显，但不易定量控制动物胸腺取材不易，价格高丰富柠檬酸钠离心机组织捣碎机可操作性较强，适宜做定量分析注：SDS：十二烷基磺酸钠 EDTA：乙二胺四乙酸二钠根据以上对比可以看出,如果从取材方面来考虑的话,以动物胸腺组织作为实验材料是不经济的,而且还要面临中学实验条件的限制等问题。我没有具体完成过该实验，如果有兴趣的话，该实验的实验方法可查阅相关资料。使用其余三种物质作为实验材料，学生的操作过程大同小异，具体数据可能会有一定的差别，以下是三种不同方法步骤的比较鸡血细胞植物组织鱼类精巢. 配质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液,按1:2的比例与新鲜鸡血混合搅拌均匀。. 将血液倒入离心管中,在1000r/min的转速下离心23分钟,弃上部澄清液. 取离心管底部的血细胞液约510ml加入到100ml烧杯中，向烧杯中加入20ml蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌5分钟，加速血细胞在低渗溶液中的破裂. 将10%的氯化钠溶液50ml缓缓倒入烧杯中，用玻棒沿一个方向搅拌，此时DNA溶解于氯化钠溶液中，滤除杂质，获得粘稠状的鸡血细胞DNA提取液. 将鸡血细胞DNA提取液置于较大的烧杯中，沿烧杯内壁缓缓倒入蒸馏水，并不断搅拌，直到粘稠状DNA不再析出为止。用玻棒搅拌，使析出的DNA缠绕于玻棒末端。为减少DNA的损失，可省略教材上要求的用纱布过滤这一步骤。. 将析出的DNA再溶解于20ml10%的氯化钠溶液中。. 在DNA的氯化钠溶液中倒入95%的酒精50 ml（冷却过的酒精效果较好），使DNA再次析出，用玻棒搅拌，使DNA再次缠绕于玻棒末端。. DNA的鉴定：取两支试管，各加入2ml10%氯化钠溶液，将DNA溶解于其中一支试管中，另一支做为对照组。然后，在两支试管内加入相同的量的二苯胺试剂，水浴加热10min左右，冷却，观察实验现象。. 取新鲜植物组织（菜花）放置于冰箱中冷却12天. 取30克植物组织,切碎,置于研体中,倒入10ml研磨液,充分研磨10分钟. 将研磨液置于离心管中，在1000r/min的转速下离心23分钟，取上清夜置于冰箱中冷却几分钟. 取1倍体积的上清液，加入2倍体积的95%的冷酒精当中，用玻棒轻轻搅拌，沉淀35分钟后可见白色絮状DNA缠绕于玻棒末端。. DNA的提纯同鸡血细胞为实验材料的实验操作步骤6、7，具体数据有一定的差异。. 鉴定（略）取成年雄性鲤鱼1条，取出精巢10克，用组织捣碎机捣碎成糜组织糜溶于500ml10%NaCL溶液中，用玻璃棒搅拌至凝胶状取部分凝胶状的DNA提取液进行DNA的提纯，提纯DNA的实验过程同以鸡血为实验材料的实验操作步骤67，具体数据有一定的差异。鉴定（略）从实验的效果来看，使用鱼类的精巢与使用鸡血细胞没有太大的区别，如果考虑实验成本的话，两者存在一定的差别。如果使用鸡血细胞作为实验材料，鸡血细胞DNA提取液的储备一定要充足，一般来说，每组学生（2人）需要使用至少5ml鸡血细胞DNA提取液，一个60人的班级则至少需要150毫升鸡血细胞DNA提取液，而鸡血细胞DNA提取液与鸡血体积比约为5：1，宰杀一只中等大小的活鸡可以获取100毫升左右的鸡血，可制备约500毫升鸡血细胞DNA提取液。可以供3个班级使用，实验成本尚可（根据具体的实验结果，在此我提供的实验数据与教学参考书上有区别）。相对于鸡血，如果使用鱼类精巢做实验材料的话，一条普通的鲤鱼的精巢约重3040克，大约可以制备粘稠状的DNA提取液2000毫升左右，每个学生一般只需要使用5ml左右的凝胶状的DNA提取液，这样一条鲤鱼的精巢可以作为至少12个班级的实验材料，可大大降低实验成本。但是从实验准备的角度来看，使用鸡血细胞作为实验材料的操作就比较简便了，用鱼类精巢虽然可以省略离心等实验准备工作，但如果没有组织捣碎机的话，制备DNA粗提取液是一件相当费事的事。植物组织作为实验材料，实验的效果并不理想，为了避免植物细胞中一些物质的干扰，需要在研磨液中须加入SDS作为蛋白质的变性剂，加入EDTA作为DNA酶的抑制剂，并依靠三羟甲基氨基甲烷/HCL缓冲体系维持DNA的稳定。在研磨过程中，往往会产生大量的气泡，而实际能获得的含有DNA的研磨液极少，而离心后得到的上清液会更少。另外，由于植物组织中DNA的含量相对较少，实验效果也会差许多。从以上实验步骤的对比可以看出，从实验准备的角度来看，使用鱼类精巢作为实验材料成本最低，由于鱼类精巢中DNA的含量极为丰富,且精巢细胞内其他生物活性物质较少，在做DNA的鉴定时能够避免其他物质的干扰，因此，我认为，如果只要求一个定性的实验结果的话，无疑,鱼类精巢是一种比较好的实验材料。如果无须精打细算且希望能尽量简化实验准备工作，鸡血细胞是一个很好的选择。具体采用哪种实验材料可酌情选择。二、 DNA的鉴定过程中的若干问题1、 二苯胺的性质：二苯胺是一种非极性芳香族有机分子，熔点比水低，微溶解于水，易溶解于酒精、冰乙酸等有机溶剂。化学性质活泼，遇光易变色。因此要放置于暗处保存。二苯胺有毒。2、 二苯胺试剂的配制：A液：1.5克二苯胺溶解于100ml冰乙酸中,在加入1.5ml浓硫酸(此处浓硫酸的作用可能是作为强氧化剂来维持试剂的稳定)，配制好的A液保存在棕色瓶中。B液：体积分数为0.2%的乙醛。由于乙醛是一种还原性试剂，所以实验前不能将A液和B液混合在一起。同时因为二苯胺试剂性质不稳定，极易变色，因此建议现配现用。3、 二苯胺试剂鉴定DNA的原理：DNA分子中的脱氧核糖在酸性环境下生成-羟基-酮基戊醛，再与二苯胺试剂结合显蓝色，颜色的深浅与溶液中的DNA含量成正比。4、 鉴定实验的一些问题：在学生实际的实验过程中，在水浴后15分钟内出现明显实验现象的比例往往非常低，经常会出现整个班级没有明显鉴定结果的现象。根据实际操作的结果，我认为很可能取决于以下几个因素： 在试管中加入一定量10%氯化钠溶液，然后再将提取出来的DNA溶解于其中，在实验过程中，经常会出现缠绕于玻璃棒末端的DNA的量过少的情况，如果溶解于氯化钠溶液中的DNA的量过少的话，与过量的二苯胺试剂共热时，出现的蓝色会比较浅。 加入二苯胺试剂时，首先观察二苯胺试剂A的颜色。新配的二苯胺试剂A呈无色，而如果放置一段时间之后，逐渐呈现浅绿色，放置几天之后，变为蓝色，如果使用该变色后的试剂，对实验结果有很大影响。因此，实验应使用新配制试剂，同时使配制好的试剂尽量避免受到强光照射。实验时，可先将试剂A滴加入溶有DNA的氯化钠溶液的试管后，再滴加几滴试剂B，震荡均匀（试剂A与试剂B不要事先混合）。 滴加入一定量的二苯胺试剂并震荡后，溶液会呈现白色浑浊（二苯胺遇水后大量析出），水浴加热后，白色浑浊可能会消失，由于二苯胺的熔点较低，最初我认为很有可能是析出的二苯胺转化为液态油滴的缘故。经多次实验，我发现白色浑浊的消失与否实际上和加入的二苯胺试剂的量的多少有关。当二苯胺试剂加入较多时，整个混合溶液体系中的醋酸浓度会相应的增大，由于二苯胺能很好的溶解与醋酸中，因此白色浑浊消失也就不足为怪了。具体的实验结果可参见下面的表格。 水浴加热510分钟后，撤去酒精灯，使试管冷却，静置一段时间后，试管中溶液变为蓝色。在实际操作过程中，我发现如果没有将试管及时冷却的话，多数情况下试管内的物质不会变色。而水浴一段时间后静置冷却，试管内会或深或浅的呈现出蓝色。因此加热后建议冷却一段时间。冷却后不同试管内溶液变色的时间可能会有差异，有的可能会立刻变色，有的则几天之后才慢慢变色。下面的表格表示了不同情况下DNA鉴定结果出现的差异（为定量表示DNA含量与实验现象的关系，本实验以鸡血细胞作为实验的材料，以鸡血细胞DNA提取液的量来表示DNA的量，所有的对照组中粗提取出的DNA均溶解于2ml10%氯化钠溶液中） 加入二苯胺试剂A2ml ：加入二苯胺试剂A后试管中出现白色浑浊，水浴加热白色浑浊很难消失鸡血细胞DNA提取液（ML）出现蓝色的时间246约1015分钟1小时1天 加入二苯胺试剂A4ml ：加入二苯胺试剂A后试管中出现白色浑浊，水浴加热白色浑浊部分消失鸡血细胞DNA提取液（ML）出现蓝色的时间246约1015分钟1小时1天 加入二苯胺试剂A6ml ：加入二苯胺试剂A后试管中出现白色浑浊，震荡后白色浑浊即可消失鸡血细胞DNA提取液（ML）出现蓝色的时间246约1015分钟1小时1天综合以上实验的分析结果，二苯胺试剂A与鸡血细胞