传代细胞培养实验.ppt

传代细胞培养实验,指导教师：费晓方,2005年5月,掌握无菌操作技术。了解传代细胞的培养的一般方法与步骤。了解培养细胞的消化分散。了解细胞计数方法。了解培养液配制方法。了解倒置显微镜的使用。,实验目的和要求：,为什么要学习细胞培养？,实验原理：,细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。还可以利用培养细胞制备染色体，分析外界因素（如理化因素）对细胞的影响，研究细胞癌变等等。在细胞培养的基础上发展了细胞融合、细胞杂交等细胞工程技术及单克隆抗体技术。,动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从有机体获取的细胞进行的培养是原代培养，若将培养细胞洗脱后转移到另外的容器中进行在培养叫做传代培养。目前，动物细胞培养技术已经达到一个新的阶段：从不同分化组织衍生得到的许多类型的细胞能够成功地在培养液中生长、反复传代。在维持一个独特细胞系长达数月的过程中，记录下细胞的倍增次数和生长速率是很有用的，以便在合适的时间传代以及在体外生活是中不同时间冻存细胞。,实验内容：,*早期细胞培养，依靠的是精湛的操作技术和尽可能的靠近火焰一达到细胞的无菌化。*目前，超净台是使工作台无菌化最经济有效的手段。（1）超净台的选择，应选择层流超净台。不能选择平流超净台。超净台应该尽可能的安装紫外灯。（2）超净台的维护，超净台的HEPA过滤层应该每一年或一年后由认可的机构进行维修。,1.工作环境及表面的处理（超净台的使用）,（3）使用超净台的方法，在每次使用前，应用紫外灯照30分钟。首先打开吹风的开关，在关掉紫外灯，打开日光灯。点燃酒精灯，开始操作。（4）超净台表面的处理。a.应做到每日清洁，以使操作中溅出的培养液或其它液体及时被清除而不蓄积，达到杜绝细菌和真菌繁殖的目的。b.工作台中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必须物应当除去。c.日常的清洁工作包括：用70%的酒精或10%的新洁而灭擦洗工作台。用固定的容器装废弃液。,2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理,用于细胞培养的器材包括：细胞培养瓶，细胞培养板，吸管，各种瓶子等。目前，上述器材均可以从商家买到无菌一次性的用品。但是，成本太高。玻璃器材，经过湿热或者干热灭菌后可以反复使用。不宜进行高温高压灭菌的器材，可以浸泡在70%乙醇中进行消毒，并在超净台上吹干。,3.实验者的操作技术,无菌操作的原则：保证细胞培养板，细胞培养皿，细胞培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作间里进行。培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开。装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外打开。细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置移取。切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源，更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入的方式及入人体，可能对研究人员造成伤害。细胞培养瓶在超净台中打开后，瓶盖应盖顶超下放置与工作台中。,如果培养的细胞已经被污染，切勿直接倒掉，应高压灭菌后倒掉处理。湿润的培养箱是常见的污染源。通常由充满液体的托盘提供培养箱合适的湿度，然而托盘本身及可导致各种细菌和真菌的污染，这种污染还可能存在与培养箱壁上和提供气体的管道上。应该定期对培养箱进行加热处理。也可以采用70%乙醇擦洗表面，并定期更换输送CO2管道，并将该管子浸泡与20%的含氯漂白剂中消毒。为了防止交叉污染，超净台中每次应进行一种细胞系的操作。不应用的细胞应及时丢弃处理，不应继续放置于培养箱中不予理睬。,4.细胞的处理以及维持细胞生长所需培养液的无菌处理。,基本培养液由必须氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和作为生长因子、激素和贴壁因子来源的血清组成。一般用碳酸氢钠（NaHCO3)体系进行缓冲。细胞的生长不仅产生CO2，也需要CO2才能生存。所以，细胞的培养需要子在CO2培养箱中CO2培养箱中CO2的浓度应与培养液中碳酸氢钠平衡。如果CO2的浓度为5%，则配培养液中应加入1.97g/L的碳酸氢钠。培养瓶盖应轻轻的拧上，不要完全拧死，以保证气体的交换。培养液的pH值应为7.2至7.4。,培养液的pH值应为7.2至7.4。高密度细胞使细胞培养液中葡萄糖耗竭并产生CO2和乳酸，在含酚红作为指示的培养液中，培养液将从红色变为橙色。细胞培养液长时间贮藏在4C冰箱中，会使培养液的pH值产生变化，变碱，是培养液的颜色呈深品红紫色。应用时可用Hepes（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸）调整。可以向培养液中加入抗生素，比如青霉素，链霉素，庆大霉素等，抑制由于操作中的微小失误而导致的低水平的感染。但是，有时由于抗生素的加入，也会使感染不易被迅速发现。,培养液的配制：,商家一般以三种形式提供培养液：1.粉末剂（需要实验着配制）2.浓缩装（用无菌水稀释即可）3.无需进一步处理的工作液形式。由于粉末剂是其中最便宜的一种，一般实验室较多采用。配制培养液需要滤菌装置：除菌器、真空泵以及0.45m或0.22m的滤膜。培养液应贮藏在4C冰箱中。配好的培养液应在无抗菌素的无菌条件下进行放置，每次配好后留样，培养72小时，观察培养液确实没有污染后使用。,学习传代细胞的培养技术,本次试验应用HeLa细胞或A375-S2细胞进行传代培养。HeLa细胞：人子宫颈癌细胞株A375-S2细胞：人黑色素瘤细胞株,实验材料：,每组的超净台中有以下物品：1.50mlRPMI1640培养液1瓶；5ml小牛血清（FCS)1瓶；2ml胰蛋白酶1瓶；1ml谷氨酰胺1瓶；1mlHepes1瓶；PBS(-)1瓶2.灭菌1ml移液管1支；装有试管的灭菌小饭盒1个；试管架1个；1ml，200l移液器各1支；枪头盒2个；细胞计数板1块；镊子1把，小烧杯1个；酒精灯1台；培养好细胞的细胞培养瓶1个,试验操作步骤：,1.从培养箱中取出细胞。在显微镜下观察细胞形态。2.倒掉原有的细胞培养液，加入5mlPBS(-)洗涤2次。3.加入胰蛋白酶100-200l，迅速前后旋转细胞培养瓶4-5次，以便胰蛋白酶包被所有细胞，于37C培养箱中孵育5分钟，消化细胞。4.在显微镜下观察，细胞变化。待到细胞变为球形，尚未从培养瓶壁上脱落下来时，用移液管吹打，使细胞从培养瓶壁上脱落下来，加入细胞培养液2-5ml。5.如果细胞不能吹打下来，再放回培养中孵育几分钟。,6.倒入50ml离心筒中，在向细胞培养瓶中加入10ml培养液洗涤，在一并倒入离心筒中，1000-2500转离心，10分钟。7.取出离心管，倒掉上清液，在桌面上轻敲离心筒，使沉降在离心筒底的细胞分散均匀。8.倒入5ml细胞培养液，混匀。细胞计数。9.取1104个细胞放入细胞培养瓶内，加入5-8ml培养液。10.显微镜下观察。11.将传代细胞放入培养箱中培养。12.两天后显微镜下观察细胞生长情况。,细胞计数：,1.按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞重悬于细胞培养液中。2.用沾有70%酒精的棉球擦净细胞计数板和盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。3.用移液器吸取细胞标本10l，加入10l台盼氏兰溶液混匀，吸取10l混合液从盖玻片的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。4.在显微镜下，计数或细胞。5.计数细胞计数板每一小室中，上下左右角和中间的大方格中（5个格）的细胞数。,6.在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计细胞数。7.合计10个大方格中的细胞。算出110-3ml的细胞数。（每个大方格110-4ml10个大方格10-3ml溶剂）细胞总数乘以1000即得每毫升计数细胞悬液的细胞数。8.计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖玻片。用擦净纸擦干。,每毫升细胞总数=(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)1032,稀释倍数,第一小室的细胞总数,第二小室的细胞总数,活力