重组DNA技术基础PPT课件

第二章重组技术基础,DNA组成与结构,一级结构碱基的排列顺序,二级结构DNA的双螺旋形式,高级结构DNA的超螺旋形式,核酸分子组成,DNA的分子结构,（一）核酸的分类,.戊糖,（构成RNA）,1,2,3,4,5,-D-呋喃核糖(ribose),（构成DNA）,-D-2-脱氧呋喃核糖(deoxyribose),2.碱基,嘌呤(purine),嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR,3.核苷(ribonucleoside),碱基核糖（脱氧核糖）连接方式：CN糖苷键碱基（9/1位）戊糖（1，位）,1,1,核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,.核苷酸(ribonucleotide),核苷（脱氧核苷）磷酸磷酸酯键,体内重要的游离核苷酸及其衍生物,AMP,cAMP,.核苷酸的连接,，磷酸二酯键,C,G,A,二、核酸的一级结构,定义：核酸中核苷酸的排列顺序（碱基序列）。,书写方法,5pApCpTpGpCpT-OH3,5ACTGCT3,竖式,横式,简化式,DNA的空间结构,一、DNA的二级结构（一）双螺旋结构,DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）,两条DNA单链分子反向平行环绕，右手螺旋走向，表面大沟与小沟相间。螺旋直径为2nm，主链：戊糖磷酸骨架位于外侧侧链：碱基对位于内侧碱基平面垂直于螺旋轴碱基距：0.34nm；螺距：3.4nm；周长：10对碱基。,碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T;GC）。,碱基互补配对,T,A,C,G,稳定因素：1.氢键维持横向稳定性，2.碱基堆积力维持纵向稳定性。3.介质中阳离子可以有效地屏蔽磷酸基之间的静电斥力,DNA双螺旋结构的多样性,A型,B型,型,（二）与DNA碱基顺序相关的特殊结构,碱基顺序颠倒重复而具有2倍对称的DNA段落,镜像重复序列,tsDNA是在DNA双螺旋结构的基础上形成的，三条链均为同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。,（三）三股螺旋DNA（tsDNA,也称H-DNA）,Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中稳定，较多见,Hoogsteen碱基配对,(四)四螺旋DNA,G四碱基体结构示意图,四螺旋DNA的生物学意义,真核染色体末端含有一个富含G的单链DNA尾巴。可自身回折形成HoogsteenG-G碱基对。两个DNA分子(染色体)可彼此连接，形成一个局部四螺旋结构，这种结构起着稳定染色体和在复制过程中保持其完整性的作用。,(五)酶活性DNA,1995年Cuenoud等发现了具有酶活性的DNA，再次丰富了酶学。Cuenoud根据共有序列设计并合成了由47个核苷酸组成的单链DNA-E47，以此连接两个底物DNAS1和S2,二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装,（一）DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,（二）原核生物DNA的高级结构,（三）DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。,DNA：约200bp组蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4,核小体的化学组成,RNA的结构,StructureofRNA,RNA的种类、分布、功能,mRNArRNAtRNA,一、mRNA的结构与功能,内含子(intron),外显子(exon),*真核细胞mRNA结构特点,5末端有甲基化鸟苷帽子结构：m7GpppNm-,2.3末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。,帽子结构,促进mRNA由胞核向胞质的转位维持mRNA的稳定性翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,*mRNA的功能把DNA的碱基序列翻译成蛋白质的氨基酸顺序。,*tRNA的一级结构特点含1020%稀有碱基，如DHU3末端为CCA-OH5末端大多数为G具有TC,二、转运RNA的结构与功能,N,N-二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶（DHU）,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,*tRNA的二级结构三叶草形氨基酸臂DHU环反密码环额外环TC环,氨基酸臂,额外环,*tRNA的三级结构倒L形,*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,*rRNA的结构,三、rRNA的结构与功能,*rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,rRNA的种类,真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA,原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA,S（沉降系数）：单位时间内的沉降速度,核酸的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid,1.核酸的溶解度核酸是极性分子，微溶于水，不溶于乙醇或异丙醇。DNA+蛋白质脱氧核糖核蛋白（DNP）：在1mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。RNA+蛋白质核糖核蛋白（RNP）：在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。,一、核酸的一般理化性质,核酸属于两性电解质，但因为磷酸的酸性较强，因此总体呈现较强的酸性。具有较低的等电点。当溶液的pH4时，呈多负离子状态，容易与金属离子结合形成盐。,2.酸碱性,3.核酸的高分子性质粘度：DNARNAdsDNAssDNA4.核酸的紫外吸收(OD260)单核苷酸ssDNA(或RNA)dsDNA,5.核酸的化学性质核酸中的嘌呤和嘧啶能进行脱氨、聚合、烷基化等反应等。脱氨：CU,脱氨：CU,A,T,C,G,A,A,T,T,G,C,A,T,U,G,A,A,T,T,A,C,千万年后，GC将不复存在,聚合紫外光诱导两个相邻嘧啶之间形成二聚体,二、DNA的变性(denaturation),定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,Tm：DNA变性时紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。,影响Tm的因素：1.G+C含量:G+C越高，Tm越高2.DNA样品均一性：均一的DNA样品，Tm范围较狭窄。3.核酸的种类：双链RNARNA-DNA杂交链DNA双链4.溶液的离子强度：离子强度高，Tm值高。,三、DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低的现象。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,不同来源的核酸链分子复性时形成杂化双链过程叫分子杂交。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础,核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶,核酸酶的分类依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解DNA。RNA酶(ribonuclease,RNase)：专一降解RNA。依据切割部位不同核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：53或35核酸外切酶。,参与DNA的合成与修复、RNA合成后的剪接等重要基因复制