WB实战指南(一)

WB实战准则(1)的样本制备关键词： WB经验指南2014-10-27 00:00来源：丁香园点击次数： 870一、样品制备：1、改性条件SDS LB直接开裂：常温或高温预热(预热有利于蛋白水解和阻止磷酸酶磷酸化，但容易忘记，LB长时间煮会改变性质)1*SDSLB (或稍高1.5* )直接加入细胞或组织中煮。 通常，6孔细胞的80%以上的密度需要200ul，其他以平板面积比类推。 在正常情况下，SDSLB是过量的(不必严格参考SDSLB稀释比)。 如果SDSLB不足，样品核酸、蛋白质浓度过高，煮的话tip就不吸附，会非常粘连、变瘦，容易堵塞tip。 此时，通常的方法有两种，煮5min。 通常煮的时间为3-5min，样品过浓的话煮10min，煮10min的话，还不能吸，所以适当增加SDS LB，也可以对持续煮的样品施加超声波。 煮的时间过长的话蛋白会凝固，这时WB没有继续的意义，请扔掉(判断基准：出现明显的蛋白沉淀和水分层)。因为该方法的缺点是将SDS LB煮的样品用于IP需要特殊的方法，所以用该制造方法制造的样品有使用限制。2、非变性裂解法(核提取、亚细胞器分离等没有讨论，但实际上相似)。分解细胞应尽量在冰上操作，放松酶解作用。我之前boss nature文章中的分解液处方为： 20mM Tris/HCl、ph7.6、100mmNaCl、20mM KCl、1.5mmmgcl2、0.5 % NP-40 andproteaseinhibitors (20g/mlleupeptin 10g/mlpeptin mlaprotinin (该分解液可用于核蛋白质提取)中，蛋白酶抑制剂复杂且昂贵，实际上为了制备将这3种物质置换为0.5mMPMSF即可的磷酸化蛋白质，需要使用1mM Na3VO4(目前有源)、10 mM NaF、10 mM NaF该方法的优点： NaCl浓度略低于生理状态，分解细胞方法温和，便于后续IP等试验。 其他Na盐浓度的细胞分裂液也很常见，例如0.15M (生理盐浓度)、0.3M、0.6M (高盐类，分裂细胞时染色体析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠)和0.8-1.2M； 0.3M以下适合IP试验，0.6M以上适合蛋白质的纯化，特别是为了得到相互作用强的复合体，纯化的部分复合体的构成蛋白质一般采用极端的高盐分解细胞。用于核蛋白质分解的原因是0.5% NP-40，可以使用到破坏核膜结构的1%，染色体析出，沉淀变得粘稠。3、组织块分裂：组织块以比较均匀的方法为最佳，现在有很多旋转小的均匀器。如果组织是超微量的，比如说50mg的新鲜癌组织，我采用的方法是(1) .低温(剪切)搅拌，制成肉糜状。(2) .锡箔纸包好，放入少量的液氮，迅速敲打(控制力量，不要破坏锡箔纸)，再破碎，重复多次。(3) .用上述细胞分解液回收。4、分泌型蛋白质丰富：在无血清培养基中培养细胞，收集上清液用于WB检查的含量过低的话，有必要用TCA进行沉淀浓缩。理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白质对细胞生长条件的影响最小，是最佳实验条件，但这一点令人担忧。 由于含血清的培养基中含有丰富的BSA (牛血清白蛋白)这样的蛋白质，因此，除非进一步分离纯化，否则用该样品直接去WB是非常麻烦的，特别是蛋白质在60-46kDa之间的情况下，用“任意”抗体检测该区间的蛋白质时，会发出非常强的信号由于该区间蛋白质(主要是BSA )浓度过高，*非特异性附着“任意”抗体，最终被识别。 同样，用SDS LB分解细胞制成样品前，通常用PBS洗涤，其目的之一是去除培养基中的BSA。用无血清培养基收集细胞，去除改变细胞生理状态的外(可能激活AKT等未知信号通路)，问题如下(1) .即使采用无血清采集上清液，仍有很多杂质，但比较多。(2) .虽然选择了上清液，但由于蛋白浓度过薄，通常用TCA沉淀浓缩，再次溶解。a. TCA沉淀的半定量操作要求非常高，由于沉淀不充分或容易失去离心操作，特别是在离心过程中，离心管的配置非常精密，必须每180度反转2次离心。b .再溶解时，蛋白质必须在一定的盐离子条件下再溶解，因此要寻找充分溶解的条件，比较麻烦。实际上，如果不强调蛋白质的分泌具有什么样的生理功能，一般不提议检测上清液，特别是半定量的WB实验中检测样品间的差异。 其中有实验操作的详细故障的经验谈，我所涉及的cancercell文章中研究的蛋白是分泌型蛋白，90%的数据是cell lysis，偶尔使用上清液，作为浓缩纯化该蛋白质的原料，准备进一步分析。样品配制完成后，应立即在低温下保存(-20度短期(数天)-80度的长期例外，IP用样品应直接进行IP，以防止冻融破坏蛋白质之间的弱相互作用。 SDSLB煮沸的样品的冻融还有另一个问题，SDS沉淀的SDS在4度沉淀，更加-80度。 在如上所述之前必须充分加热溶解。 否则，从样品口降低带子(SDS LB不足，样品不充分溶解的话就像拖尾)。 即使上面的形状太大)。在样本制造过程中，另一个要注意的问题是WB自身的系统误差为20%，从样本制造的初始阶段就注意到了定量问题，而细微的差异往往被忽略。 细胞样品可以计数接种，短时间内细胞生长有差异对WB结果影响不大。 组织样品可根据肿瘤组织的大小(重量)，准确定量裂解液的体积，操作过程也尽量避免蛋白损失。 有人说电泳前蛋白质的定量是可行的，下一节就蛋白质定量的不科学性和对分解液成分定量的干扰进行探讨。【补充】:细胞凋亡和生长速度有差异的情况最直接的方法就是针对这个问题，在实际收集细胞后，离心去除PBS，与事先准备的标准体积相比，误差小于50ul (标准品的差异可以设定为50ul，基本上肉眼偏差最多为10ul (细胞体积)，