葡聚糖凝胶柱使用及注意事项(包含各种溶剂的溶胀系数)

葡聚糖凝胶柱的使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟基丙烷化后为Sephadex LH-20。 分子筛作用，极性和非极性溶剂组成的溶剂具有反相色谱效应。 虽然价格高，但性能优良，可以再生利用，所以很受欢迎。 另外，上柱样品损失少，处理小样品也是我们实验室常用的原因之一。2 Sephadex LH20的原理。Sephadex LH20的分离原理主要以凝胶过滤作用为主，兼有反相分配作用(反相溶剂中)。 由于凝胶过滤作用，大分子的化合物保持较弱，先被洗脱，小分子的化合物保持较强，最后出柱。 用反相溶剂洗脱时，Sephadex LH20对化合物也起到反相分配的作用，因此极性大的化合物在弱的状态下洗脱，极性小的化合物在强的状态下出柱。 用正相溶剂洗脱时，这主要通过凝胶过滤作用分离。3 Sephadex LH20溶出溶剂。从第2点来看，明确了Sephadex LH20洗脱溶剂分为反相和正相两种。 使用最多的是反相溶剂洗脱，在甲醇水系中最常见，首先用水逐渐增加甲醇的比例，最后用100%甲醇冲洗色谱柱。 正相体系以氯仿甲醇最为常见，首先为50%氯仿甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱。4 Sephadex LH20样品的处理和洗脱溶剂的选择。样品极性大的话，其用反相溶剂洗脱(甲醇水)，样品用最低体积的甲醇水(尽可能少的甲醇)溶解，过滤后，用湿式保持原样(必须过滤)。 塞住了sephadeexlh20，就得扔掉sephadeexlh20的柱头部分，好痛。 样品极性小时，其用正相溶剂洗脱(氯仿甲醇)，样品用最低体积的氯仿甲醇溶解，过滤后，用湿法取样。5 Sephadex LH-20的步骤。(1)选择条件：梯度洗脱在使用Sephadex时没有正相柱色谱那么重要。 首先，你的样品必须尽量溶解在少量洗脱剂中。 极性的甲醇水系统极性小的人一般使用不含水的系统。 我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，使用多年，效果良好。(2)饱和色谱柱：用洗脱剂摇动凝胶，直立自然沉降，防止气泡残留。 目的是打开开关至少30分钟，使若干柱种的洗脱剂流出，膨胀成正确比例的洗脱剂。(3)样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。(4)湿式上柱。 这也是一个技术步骤。(5)溶出：控制流速，一般在1drop/s以下，根据需要改变极性，可以参照制造商的参数(一个极性大多可以溶出样品)。为了下次的使用而再生。6分离技巧，最后说说我的使用体会(1)流速不要太快，千万不要太快，不能说速度。(2)柱尽可能长，Sephadex LH20柱增长大大改善了分离，不惜填充剂，倒不如将填充剂放入一根大柱，将填充剂放入几根小柱。 集中所谓优势兵力，打击敌人。(3)馏分必须接触的细节可以取1/10或1/20个保留体积作为一馏分。(4)溶出体积通常为23个保持体积，对于特殊的保持强的化合物，可以溶出5个保持体积。(5)鞣质成分的死吸附严重，不在意填料者，用Sephadex LH20分钟鞣质。(6)Sephadex LH20的黄酮类成分分离效果优良，方法成型，参考了很多文献。(7)填充剂反复使用，每次使用完毕，一般用甲醇洗柱子，用下一个分离的起始溶剂替换甲醇等待。Sephadex LH-20是通过葡聚糖G-25的羟丙基化加工而成的分子筛凝胶，特别适合天然物质在有机溶剂中的纯化。 例如，类固醇、萜烯类、脂质和小分子多肽等Pharmadex LH-20可以同时应用于分子类非常类似的物质的分离和工业规模的调制，可以用于初步的精制工序，也可以用于非对映异构体的分离等最终的精制工序。1 .搭柱子装填的一个重要原则是形成稳定均匀的柱床。 糊粒子越均匀(粒径分布越窄)，越容易得到稳定的均匀柱床。 但是，在Sephadex LH-20中，25100m的粒径范围，对于制造色谱的很多填料，不能说分布均匀，即粒径分布宽。 但胶水膨胀容易得到比较均匀的柱床。 对于长柱(最大250cm )也同样如此。 在安装管柱之前，管柱和油箱必须彻底清洗。Sephadex LH-20在使用前必须溶胀。 在溶胀过程中，不要过度搅拌。 否则，球状凝胶粒子会被破坏，请避免使用磁力搅拌器。在室温下使凝胶在色谱溶剂中溶胀3小时以上，溶胀后的凝胶体积的大小取决于所使用的溶剂系统。 请参照后页的干凝胶膨胀表，计算特定柱体积所需的干凝胶量。 溶胀凝胶的体积沉淀后，占总体积的75%，上层溶剂占25%时，将悬浊液从一个容器注入另一个容器，凝胶粒子就会移动。 根据柱的要求，使膨胀的凝胶均匀地流入柱内，在尽可能高的压力下安装柱，以免凝胶粒变形，反压不要超过1.5ba。2 .平衡在此之前，用洗脱液使色谱柱的至少2个柱体积平衡，在基线变得平滑之前，改变溶剂时要注意凝胶对新溶剂的膨胀性，根据性质决定柱的高度调节器的位置。 如果使用相同的溶剂，今后色谱的中心平衡可以省略。3 .洗脱液为了延长断层柱的寿命，所有缓冲液必须离心或经过0.45um的超滤除去杂质。4 .样本样品体积应占整个柱体积的1-2%，同样使用前样品必须离心或经过0.45um的超滤。5 .溶出洗脱流速根据情况，最大线性流速约为12cm/min (反压1.5ba )，推荐流速为1-10cm/h。 总体来说，流速低，分辨率高。6 .再生凝胶再生通常用23柱的洗脱液进行洗涤，更换洗脱液后必须恢复平衡。7 .体积流速与线性流速的关系线性流速=体积流速/截面积8 .膨润体积Sephadex LH-20的膨胀体积依赖于溶剂，因此对于直径不同的柱，可以按比例增减旧的柱体积来计算新的体积。新体积=旧体积(新柱体积/旧柱体积)9 .糨糊的性质Sephadex LH-20兼具亲水性和脂质的二重性，分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。10 .排放阻力极限4-5KD (与使用溶剂有关)11 .以上的量吸附模式依赖于所需分辨率分子量大小小于总体积的20%正相的分配小于总体积的1%12 .其他事项胶体颗粒形状为球形，多孔粒子尺寸(干燥) 18-111um (直径)粒子大小的中间值(树干) 70um (直径)粒子尺寸(甲醇) 27-163 m (直径)粒子大小中间值(甲醇) 103 m (直径)最大线性流速720cm/min参考线性流速60 cm/minpH的稳定性动作中2-11清洗中2-13化学稳定性在许多水溶液和有机溶剂体系中是稳定的。 pH2以下或强氧化剂不稳定高压灭菌121可承受20种工作温度为4 40保存条件新型填料4-25(干燥)使用后加入填料4-8、pH6-8、不冻结抗菌剂(例如20%乙醇、0.04%叠氮化钠)13 .干胶膨润表溶剂床体积(ml凝胶/g干橡胶粉末)dimethylenesulphoxide二甲基亚砜4.44.6Pyridine嘧啶4.24.4Water水4.04.4Dimethylformamide二甲基甲酰胺3.84.2Saline生理盐水3.94.1Methanol甲醇3.84.1Methane dichloride二氯乙烷3.84.1氯仿*氯仿3.84.1丙醇3.74.0Ethanol*乙醇3.63.9Isobutanol异丁醇3.63.9Formamide甲酰胺3.63.9Methylene dichloride二氯甲烷3.63.9Butanol丁醇3.53.8Isopropanol异丙醇3.33.6Tetrahydrofuran四氢呋喃3.33.6Di