朱载华-三氧化二砷对MRLlpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化的影响.ppt

三氧化二砷对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化的影响,研究背景,系统性红斑狼疮,系统性红斑狼疮,系统性红斑狼疮发病机制,T、B细胞的过度活化,T细胞DNA呈低甲基化,DNA甲基化酶的活性下降,自身抗体、免疫复合物形成,IFN-和IL-4明显升高,系统性红斑狼疮发病机制,目前认为，DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传学机制在系统性红斑狼疮的发病机制中起重要作用。,三氧化二砷（ATO）的临床应用,我国自1992年率先采用亚砷酸治疗急性早幼粒细胞白血病获得成功，缓解率高，副作用小。美国FDA于2000年批准ATO注射液上市作为复发性急性早幼粒细胞白血病的二线治疗药物。,LeoniF,GianfaldoniG,AnnunziataM,etal.Arsenictrioxidetherapyforrelapsedacutepromyelocyticleukemia:abridgetotransplantationJ.Haematologica,2002,87(5):485-489.,ATO研究进展,ATO能通过改变DNA甲基化水平来影响、调控基因的转录。如：促进多种肿瘤基因（bcl-2、p53、p16等）启动子的甲基化。2006年法国学者PierreBob等在BLOOD杂志上发表论文提出ATO对狼疮鼠有治疗作用。,BobeP,BonardelleD,BenihoudK,etal.Arsenictrioxide:ApromisingnoveltherapeuticagentforlymphoproliferativeandautoimmunesyndromesinMRL/lprmiceJ.Blood,2006,108(13):3967-3975.,本课题组研究基础,体内研究,ATO对BXSB狼疮小鼠有免疫抑制作用,体内研究,ATO能降低发病早、晚期的MRL/lpr小鼠血清抗ds-DNA抗体、IFN-和IL-4的水平,体外研究,ATO能抑制MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞的增殖，降低其IFN-和IL-4的基因转录和翻译水平,ATO能提高MRL/lpr狼疮鼠脾脏及淋巴结的DNA甲基化水平,体内研究,研究目的,研究目的,MRL/lpr狼疮小鼠和C57小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化的对比；观察ATO对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化的影响；探讨ATO对SLE的治疗机制，及其逆转MRL/lpr狼疮小鼠IFN-和IL-4基因启动子低甲基化之间的关系。,实验方法,动物模型,MRL/lpr小鼠，含有与细胞凋亡有关的Fas基因隐性突变，症状与人类红斑狼疮相似，包括显著的血清自身抗体、免疫复合物肾小球肾炎、血管炎等。其发病年龄约为10-12周。,Santiago-RaberML,LaporteC,ReiningerL,etal.GeneticbasisofmurinelupusJ.AutoimmunRev.2004,3(1):33-39.MizugakiM,YamaguchiT,IshiwataS,etal.AlterationofDNAmethylationlevelsinMRLlupusmiceJ.ClinExpImmunol.1997,110(2):265-269.SawalhaAH,JeffriesM.DefectiveDNAmethylationandCD70overexpressioninCD4+TcellsinMRL/lprlupus-pronemiceJ.EurJImmunol.2007,37(3):1407-1413.,实验分组（n=20）,PBS组：空白对照ATO组：1.0mol/LATO5-AZA+ATO组：1.0mol/L5-AZA+1.0mol/LATO,实验路线图,PBS组,CD4+T细胞,IFN-和IL-4基因启动子甲基化水平测定,ATO组,5-AZA+ATO组,DNA抽提,实验方法-CD4+T细胞的分离和培养,实验方法-基因启动子甲基化水平测定,CD4+T细胞基因组DNA抽提；DNA亚硫酸氢盐修饰；PCR扩增IFN-和IL-4基因启动子；CpG岛中非甲基化CUT；CpG岛中甲基化mCCCCpG岛以外序列中的CUT。DNA凝胶回收；TA克隆构建克隆载体；抗性及蓝白斑筛选获得阳性克隆子；原位PCR鉴定；提取质粒；测序,pcr,pcr,pcr,统计学处理,特异CpG位点甲基化率=（某单个CpG位点上测出为甲基化的CpG个数/该CpG位点重复测序样本量）100%。特异CpG位点甲基化率采用Fisher确切概率法。,统计学处理,表示甲基化状态，表示非甲基化状态,WenzhouMedicalCollege,统计学处理,启动子平均甲基化率=（该启动子甲基化的CpG个数/所在启动子CpG总数）100%。启动子平均甲基化率两个样本间采用独立样本t检验，方差不齐时采用校正t检验，多组样本间比较采用方差分析，方差不齐时采用Dunnettst3检验，P0.05为差异有统计学意义。,WenzhouMedicalCollege,统计学处理,第1个样本启动子甲基化率=（1/8）100%=12.5%,实验结果,MRL/lpr小鼠IFN-基因启动子测序图（PBS组）,MRL/lpr小鼠IFN-基因启动子测序图（ATO组）,MRL/lpr小鼠IFN-基因启动子测序图（5-AZA+ATO组）,IFN-基因启动子序列测定结果（MRLvsC57）,表示甲基化状态，表示非甲基化状态,IFN-基因启动子序列测定结果（组内比较）,表示甲基化状态，表示非甲基化状态,IL-4基因启动子序列测定结果（MRLvsC57）,表示甲基化状态，表示非甲基化状态,IL-4基因启动子序列测定结果（组内比较）,表示甲基化状态，表示非甲基化状态,基因启动子平均甲基率（n=20,xs）,PBS组IFN-启动子甲基化率：MRLvsC57,PBS组MRL/lpr狼疮小鼠IFN-启动子区平均甲基化率(8.112.4)%显著低于C57BL/6J小鼠(63.123.5)%，P0.05；,5-AZA+ATO组IFN-启动子甲基化率：MRLvsC57,5-AZA+ATO组MRL/lpr狼疮小鼠IFN-启动子区平均甲基化率(50.029.2)%与C57BL/6J小鼠(51.922.3)%之间无显著性差异,P0.05；,5-AZA+ATO组IL-4启动子甲基化率：MRLvsC57,5-AZA+ATO组MRL/lpr狼疮小鼠IL-4启动子区平均甲基化率(51.022.0)%与C57BL/6J小鼠(60.024.3)%之间无显著性差异，P0.05,PBS组：(8.112.4)%ATO组：(46.931.6)%ATO+5-AZA组：(50.029.2)%,MRL/lpr小鼠组内IFN-基因启动子甲基化率,PBS,ATO,5-AZA+ATO,MRL/lpr小鼠组内IL-4基因启动子甲基化率,PBS组：(14.014.7)%ATO组：(52.028.6)%ATO+5-AZA组：(51.022.0)%,PBS,ATO,5-AZA+ATO,C57BL/6J小鼠组内IFN-基因启动子甲基化率,PBS组：(63.123.5)%ATO组：(51.920.0)%ATO+5-AZA组：(51.922.3)%,PBS,ATO,5-AZA+ATO,C57BL/6J小鼠组内IL-4基因启动子甲基化率,PBS组：(55.018.2)%ATO组：(59.017.7)%ATO+5-AZA组：(60.024.3)%,PBS,ATO,5-AZA+ATO,讨论,讨论一,国内外报道：MRL/lpr狼疮小鼠发病期DNA甲基化水平明显下降。本实验发现：发病期MRL/lpr狼疮小鼠PBS组Th细胞因子IFN-和IL-4基因启动子呈现低甲基化水平，而正常对照C57BL/6J小鼠PBS组则表现为高甲基化水平。,Santiago-RaberML,LaporteC,ReiningerL,etal.GeneticbasisofmurinelupusJ.AutoimmunRev.2004,3(1):33-39.MizugakiM,YamaguchiT,IshiwataS,etal.AlterationofDNAmethylationlevelsinMRLlupusmiceJ.ClinExpImmunol.1997,110(2):265-269.SawalhaAH,JeffriesM.DefectiveDNAmethylationandCD70overexpressioninCD4+TcellsinMRL/lprlupus-pronemiceJ.EurJImmunol.2007,37(3):1407-1413.,讨论一,本科题组既往体内外实验证实：发病期MRL/lpr狼疮小鼠Th细胞因子IFN-和IL-4表达明显高于C57BL/6J正常对照小鼠，但机制未明。上述结果结合本实验提示：SLE发病相关的两个关键细胞因子IFN-和IL-4转录表达的调控可能通过染色质水平启动子的甲基化进行，其启动子低甲基化可能是导致IFN-和IL-4基因转录表达量增加的机制之一。,讨论二,本课题组已证实：ATO能够逆转MRL/lpr狼疮小鼠Th细胞活化状态下IFN-和IL-4分泌和转录水平的异常高表达，但机制尚未明。本实验证实：ATO提高MRL/lpr狼疮小鼠Th细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化水平。推测：ATO可能通过提高MRL/lpr狼疮小鼠Th细胞IFN-和IL-4基因启动子的甲基化水平，或者作为其中的机制之一，来抑制其基因的表达。,讨论三,本课题组已证实：ATO对C57BL/6J小鼠Th细胞IFN-和IL-4分泌和转录水平的无明显影响，具有良好的安全性，但机制未明。本实验证实：ATO对C57BL/6J小鼠Th细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化水平无显著影响。推测：ATO对免疫正常，即非活化状态下的Th细胞因子IFN-和IL-4基因启动子甲基化无影响，而只对异常增生活跃的狼疮小鼠Th细胞因子IFN-和IL-4基因启动子甲基化有促进作用，进一步证实其选择性甲基化促进作用和免疫抑制调节功能，说明了该浓度药物和作用时间的安全性。,讨论四,本课题组体内实验发现：5-AZA能降低MRL/lpr狼疮小鼠脾脏、淋巴结及血液的DNA总体甲基化水平，提高血清中抗dsDNA抗体水平。本课题体外实验发现：5-AZA能增加MRL/lpr狼疮小鼠和C57BL/6J小鼠Th细胞IFN-和IL-4的分泌及其mRNA水平，ATO处理经5-AZA预处理的上述细胞后，上述因子的分泌和mRNA表达受到抑制。,讨论四,本实验证实：ATO能促进5-AZA预处理的MRL/lpr狼疮小鼠Th细胞IFN-和IL-4基因启动子的甲基化水平，并且与单用ATO及C57BL/6J小鼠Th细胞IFN-和IL-4基因启动子的甲基化水平无显著差异。推测：启动子处于进一步低甲基化的情况下，ATO仍然能提高其甲基化水平，而且升高后的DNA甲基化水平与C57BL/6J