第一章抗原抗体反应ppt课件

第一章抗原抗体反应，免疫学诊断技术概述，(4小时)，检测抗原准备技术，第一节抗原抗体反应的原理第二节抗原抗体反应的特性第三节抗原抗体反应的影响因素第四节免疫学检测技术的类型，第一节抗原抗体反应的原理，抗原抗体反应，主要是抗原和抗体在体外结合而产生的反应。抗体主要存在于血清中，并通过临床使用血清进行检查，因此体外抗原抗体反应被称为血清反应。但是随着免疫学的发展，血清学的意义不再能够概括当前的研究内容，现在用抗原抗体反应取代了血清反应这个词。Ag:AntigenAb:Antibody，抗原抗体反应的原理，抗原抗体反应：表示抗原和相应抗体之间发生的特定结合反应。物质基：表位和抗体高变量区间的互补耦合表位和抗体高变量区的沟槽分子表面的结合抗原抗体之间的结合力亲水胶体转换为疏水胶体，静电重力范德华重力3360最小作用例如，抗体分子中带电荷的碱性氨基酸的游离氨基(-NH3)和酸性氨基酸的游离羧基(-COO-)，可以与抗原分子中带相反电荷的对应组相互吸引。这个重力的大小与两个相互作用器之间距离的平方成反比。2 .当范德瓦尔斯重力、抗原和抗体相互接近时，分子的极化作用所产生的重力称为范德瓦尔斯重力。结合力的大小与两个相互作用器的极化程度的乘积成正比，与两者之间距离的7次方成反比，键能约为4.2-12.5kJ/moL。这种重力的能量比静电重力小。3.氢键力，氢体中氢原子和氢的原子之间的重力。在抗原抗体反应中，羧基、氨基和羟基是主要的氢供应体，但羧基氧、羧基碳、肽键氧等原子主要接受氢。氢键结合力与氢和氢体之间距离的6次方成反比，结合能约为20.9kJ/mol。4 .疏水作用力，两个疏水组在水溶液中相互接触时由于对水分子的排斥而倾向于聚集的力称为疏水或疏水耦合。抗原抗体反应时，抗原决定群靠近抗体上的结合点，彼此之间的正负极性消失，静电形成的亲水层立即消失，从而促进抗原和抗体的相互吸附。在抗原抗体反应中，疏水的结合很重要。提供了占总合力约50%的最大力。抗体分子上一个抗原结合点和该抗原决定簇之间的对应存在的重力有抗原之间的固有结合力，亲和性，亲和性，抗原抗体亲和性图，第二，抗原抗体亲和性和亲和性，抗体结合部分和抗原决定簇之间的结合强度，亲和性，亲和性据说，k值大的抗体与抗原紧密结合，不易解决，该抗体具有较高的亲和力。第三，亲水胶体转换成疏水胶体，抗体和大部分抗原都属于蛋白质。在一般的血清反应条件下，带负电荷的极化水分子在其周围形成水合层，成为亲水胶体，因此蛋白质不会自行凝聚沉淀。Ag和Ab结合后，表面电荷减少，水合层变薄。并且随着Ag-Ab复合物的形成，与水接触的表面积减少，从亲水胶体过渡到疏水胶体。NaCl等电解质的作用，使各疏水胶体之间更接近并沉淀，形成可见的Ag-Ab复合物。，可见反应，抗原抗体复合物(疏水胶体)，电解质，抗原(亲水胶体)，抗体(亲水胶体)，3，亲水胶体转化为疏水胶体，双节抗原抗体反应的特性，特定可逆比例阶段，特异性：抗原和可逆性，可逆性：抗原和相应抗体结合为复合物，在一定条件下，可分为自由抗原和抗体的特性，影响因素：抗体对该抗原的亲和力-亲和力越高，结合越强，环境因素对复合物的影响就越不容易解决-ph，离子强度，Ag和Ab的结合往往必须以适当的比例出现，反应，最佳比例最大这种现象可以用“格主义”来解释。Ab(IgG)变为2，Ag通常接近，Ag，Ab组合形成大的复合物，才能肉眼看到。第三，比例，晶格理论，肌红蛋白：肌红蛋白，Ag和Ab的比例适当时才能形成大复合体，如果比例不合适，只能形成小复合体，抑制反应现象的出现，所谓带状现象；前频带现象：Ab过量，Ag太少；稀释Ab，絮凝反应常见；后皮带现象：Ag过量，Ab太少；稀释Ag，沉淀反应常见。前带现象，后带现象，前带：抗体过量带：抗原过量对等带：抗原抗体比例合适，抗原抗体反应比例图，比例：抗原和抗体可见反应是一定的量比关系，3，比例，比例反应物本身的因素、抗原：物理特性、表位瘤和数抗体3360来源、特异性、亲和性、效价、1、抗原抗原的理化特性、抗原决定基的数量和种类都可能影响血清反应结果，可溶性抗原与相应抗体反应沉淀，颗粒性抗原和相应的抗体反应凝聚。 单价抗原和抗体的结合没有可见反应。粗糙的细菌容易在生理盐水中自行凝固。红细胞和IgG抗体不会直接引起凝集。第一，反应物本身的因素，抗体对反应的影响，在以下三个方面，(1)源：发生在其他动物的免疫血清中，反应性有差异。兔子等大部分动物的免疫血清具有宽而平等的带，可溶性免疫复合物只有抗原过量时才容易出现。像马这样的大动物和人的免疫血清对等带很窄，少量抗原或抗体过量可以形成可溶性免疫复合物；家禽免疫血清不能与哺乳动物的补体结合，高盐浓度(8.5%NaCl)溶液中沉淀现象明显。单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或絮凝反应。2，抗体，(2)特异性和亲和力：特异性和亲和力是影响检查结果准确性的两个关键因素。免疫动物早期获得的抗血清特异性好，但亲和力低。后期获得的抗血清一般具有较高的亲和力，但长期免疫使免疫血清中抗体的种类和反应性更加复杂。因此，为了保证和提高测试结果的可靠性，诊断用的试剂应尽可能使用特异性强、黏附性强的抗体。(3)浓度3360抗体的浓度通常是相对于抗原的。在适当的浓度下才会出现明显的反应现象。因此，很多检查要进行抗体预滴定，找出最佳反应浓度。，l .电解质抗原抗体结合后，亲水性变为疏水，此时容易受到电解质的影响，因此，如果存在合适浓度的电解质，抗原抗体就会失去部分电荷，相互凝聚或沉淀，出现可见反应；没有电解质，就不会出现可见反应。一般血清检查使用8.5%NaCl溶液作为抗原抗体的稀释液和反应液，其中Na和Cl-银分别中和胶体粒子的电荷，降低胶体粒子的电位，形成可见的沉淀物或聚合体。但是如果电解质浓度太高，就会出现非特异性蛋白质沉淀，盐分。第二，环境因素，2 .ph适当的pH是抗原抗体反应的必要条件之一。血清检查一般适合pH6-9，超出此范围会影响抗原和抗体的理化性质，从而导致假阳性或假阴性结果。当PH值为3左右时，接近细菌抗原的等电点，就会出现非特异性酸聚集，形成幻想。3 .温度抗原抗体反应一般可在15 40范围内进行，最佳温度为37 。在此范围内，温度越高，分子运动速度越快，抗原抗体接触机会增加，反应速度快，但也容易产生复合物释放。温度越低，反应速度越慢，但抗原抗体结合结实，易于观察。某些特殊抗原抗体反应需要特定的温度，例如冷凝集素在4 与红细胞结合，在超过20 的地方反而被溶解。4，作用时间，抗原抗体反应根据反应时间需要足够的时间。此外，抗原抗体反应在液体中反应时适当震动和搅动，会促进抗原抗体分子的接触，从而加快反应。电解质：生理盐水或缓冲液ph :pH6 pH9温度333615 40，37 最佳，2，环境因素，4节免疫学检测技术类型，原则：在抗体中积累可用性抗原层，如果两者一致，则抗原，抗体营养液此外，沉淀带对构成它的Ag，Ab具有特定的不透水性，对其他Ag和Ab可以通过，因此一个沉淀带只代表一个AgAb系统的沉淀。双向琼脂扩散试验，刺激身体的免疫系统，产生特定的免疫反应，检测相应的免疫反应产物(抗体或致敏淋巴细胞)和体外有特定反应的物质，或免疫原性物质的一种抗原。完全抗原：反应性免疫原性抗原：只有具有反应性，没有免疫原性的物质。病原体及其病原体的代谢、分泌及粪便等天然抗原都可以用作良好的检测抗原。那种取决于病原体的种类。微生物的衣原体、支原体、细菌、钩端螺旋体、立克次体、真菌、放线菌等病原体的表面结构蛋白，以及各种外毒素、内毒素、酶等毒性因子、噬菌体、病毒的各种结构蛋白，如利尿剂、涂膜剂中的各种糖蛋白、基质蛋白、基质蛋白大多数寄生虫是多细胞生物，抗原复杂多元，具有物种和生活史不同时期的特异性。来自蠕虫结构质的蠕虫抗原、蠕虫的粪便和分泌物中的蛋白质或多肽、糖脂或多糖多糖等代谢性抗原、生活虫排出或脱落到宿主，可能出现在血液循环中的大分子颗粒性循环抗原等，都可以用作检测抗原。抗生素等药物分子量小，没有抗原性。只有与牛血清白蛋白等大分子结合，才有完全抗原的特性。自然感染或人工感染，以及人工培养蛋白质、多肽、酶等致病有机体的生物大分子物质，只有分离纯化，才能作为特异性更好的检测抗原。分离纯化方法包括选择性沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、电泳、超速离心法、色谱等。用于蛋白质和酶的提取，多采用选择性沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法。(a)分离纯化方法(1)饱和硫酸铵法：盐析沉淀法是经典蛋白质和酶纯化分离技术。最常见的方法是将饱和硫酸铵按33%50%顺序沉淀3次。将盐析沉淀的蛋白质溶液放入透析器，用蒸馏水或缓冲液，4 的冰箱透析，将蒸馏水或缓冲液更换3次，直到包里的盐完全透析。还可以使用葡聚糖凝胶色谱脱盐。(a)分离纯化方法(2)有机溶剂沉淀：一般用乙醇或丙酮，添加时要搅拌好，pH值在大部分要沉淀的蛋白质的等电点附近用4 冰箱调节。(3)分子筛色谱：也称为凝胶过滤器，利用分子筛将抗原分为大、中、小三种类型。(。特别是早期纯化后，蛋白质和酶抗原用这种方法进一步纯化，其效果尤为明显。(a)分离纯化(4)亲和层析：亲和色谱定律是利用生物大分子的生物特异性设计的色谱分离技术。抗原抗体、酶和酶抑制剂或配体、酶蛋白和辅酶、DNA和RNA、激素和受体之间有特殊的亲和力，在一定的条件下，这两者可以结合形成复合物。将一侧固定在托架上，可以从溶液中提取并分离另一侧。亲和层析能达到很高的纯度。有时，只需一步精制就可以达到精制的目的。(b)抗原的定性鉴别纯化蛋白抗原的定性鉴定，通常用作免疫电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。精制蛋白质抗原浓度的定量测定可用作缩脲法、苯酚试剂法或紫外线吸收法。(c)抗原的浓度(1)精制的抗原通常浓缩为聚乙二醇(PEG)、凝胶、蔗糖等吸收剂。使用peg或蔗糖吸收剂时，首先将生物聚合物溶液放入透析器，拧紧袋口，复盖吸收剂，包内溶剂渗出液被吸收剂吸收，吸收剂饱和后，可更换到所需浓度为止。吸收剂可以加热去除吸收的水分，然后再用。将生物聚合物溶液放入透析器，拧紧口袋，在通风机旁边放入风，使水慢慢蒸发，起到浓缩的作用。(c)抗原的浓度(2)超滤浓缩是使用特定孔径的滤膜选择性过滤溶液中各种溶质分子的方法。溶液在一定压力下通过滤膜时，溶液和小分子物质可以通过，但大分子留在原溶液中。超滤浓缩特别适合蛋白质和酶的富集和脱盐，可用于生物大分子的分离和纯化。(4)抗原的保存浓缩抗原可用于液体或干燥状态的低温保存。液体储存样品要浓缩到一定浓度后包装保管，并采取严格的防腐措施。常用的防腐剂有甲苯、氯仿、氮杂钠、硫脲汞等。常用的稳定剂有甘油、蔗糖等。低温干燥保存：将抗原冷冻干燥，保存在0 4。摘要抗原抗体反应是指抗原和相应抗体之间发生的特异性结合反应。抗原抗体之间的结合力与静电重力、范德华重力、氢键和疏水作用力有关。抗原抗体反应的特点是特异性、可逆性、比例性和阶段。影响抗原抗体反应的因素包括反应物本身和环境因素