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文档简介

.,1,间接免疫荧光-检测人外周血单个核细胞,武汉大学基础医学院免疫学教研室熊洁,.,2,原理,间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合，形成一个Ag-Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。,.,3,外周血单个核细胞分离-葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法原理外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。,.,4,材料1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为1.0770.001g/L）2、2台盼蓝染液3、Hanks液或者RPMI-1640培养基4、试管、吸管、水平离心机等,.,5,方法1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2mlHanks液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）3、室温2000rmin离心20min。管内可分为四层。,.,6,.,7,4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2-5mlHanks液的离心管中，混匀。5、室温下，1500rpm离心10min。,.,8,6、弃上清，重复洗涤一次。用完全RPMI-16401ml定容，计数细胞，调整细胞浓度。一般每ml血可分离出1-2106个单个核细胞。7、细胞活力检查取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，作湿片高倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。一般活性应在95以上。,.,9,材料,1.AgPBMC2.Ab1兔抗人白细胞血清(Ab1)3.Ab2FITC-抗兔单克隆抗体(Ab2)4.洗涤液5.荧光显微镜,.,10,方法,1.制备抗原片:吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背面中央,静止5-10分钟，待PBMC干燥。2.15ulAb1加入玻片上37孵育30min。PBS洗3次(3min/次)。,.,11,3.玻片上加15ml荧光二抗(Ab2)湿盒内37孵育30min。PBS洗3次(同上,避光操作
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