GM试验的原理操作及应用(推广课件).ppt

GM试验的原理、操作及应用,客服技术培训中心2013年8月,目录,一、侵袭性曲霉菌病二、GM试验原理及使用方法三、GM试验的临床应用,曲霉菌,曲霉菌(Aspergillus)是广泛存在于自然界一种腐生菌，孢子较小，直径23um，可在空气中漂浮，可通过呼吸道进入人体。,1LinSJ,etal.JClinInfectDis,2001,32(3):358-366,多种曲霉菌都可引起侵袭性曲霉病，如烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉和构巢曲霉等，90%报道的患者都是由烟曲霉感染所致病1。,烟曲霉,黄曲霉,黑曲霉,侵袭性曲霉患者在血液科和ICU最为常见,1994-1999年法国一项前瞻性流行病学调查结果,Cornetmetal.JHospinfect.2002;514:288-296,曲霉菌感染的发生率,相关重点科室：血液科，呼吸科，ICU科，肿瘤科，移植科室等,Teutsch,etal.ClinInfectDis.2001,32:358,不同基础疾患下侵袭性曲霉感染的死亡率,曲霉菌感染的死亡率,不同诊治情况下侵袭性曲霉感染的死亡率,100%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%,死亡率,未能诊断，未治疗,病程10天以上,经验性早期诊治,有效药物治疗,100%,90%,65%,40%,DavidWDenning,TheLancet,2000,February5,Vol355,IFD诊断延迟时间与死亡率的关系,GareyKWetal.ClinInfectDis2006,43:2531,早期诊断和治疗已成为当今医学领域共同关注的重大问题！,临床及影像学表现病原学证据无菌部位培养阳性（培养和非培养方法）组织病理学阳性高危患者拟诊临床诊断确诊预防用药经验性治疗抢先治疗靶向治疗深部真菌病诊断与治疗策略,曲霉菌的实验室检测方法,涂片：敏感性和特异性均较低。,无菌体液培养：耗时长，阳性率低。,1,3-D-葡聚糖检测：G试验,不能鉴别菌属,半乳甘露聚糖抗原检测：GM试验曲霉菌抗体检测：抗半乳甘露聚糖抗体检测试验,一、传统方法,二、针对真菌感染标记物的早期快速检测方法,病理切片：取材困难，阳性率低。,金标准,检测曲霉菌属,GM试验被列入真菌诊断和治疗的指南,欧洲癌症治疗研究组织(EORTC)美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组(MSG)批准用于真菌诊断中国血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(第3次修订),GM实验在欧洲已用了十多年，2003年经FDA认可在美国使用。有2/3的血液肿瘤患者在其他诊断方法阳性之前6-14d（平均8天）即可检测到GM抗原【1】。适于侵袭性曲霉感染的早期诊断。【1】MaertensJ,Van-EldereJ,VerhagenJ,etal.Useofcirculatinggalactomannanscreeningforearlydiagnosisofinvasiveaspergillosisinallogeneicstemcelltraspants.JInfectDis,2002,186(9):1297-1306,GM试验阳性是侵袭性曲霉菌感染诊断标准中重要的微生物学依据可实现侵袭性曲霉菌感染的早期诊断可实现对高危人群曲霉菌感染的动态监测可对抗真菌治疗提供用药依据和进行药效学评价,GM试验的临床意义,侵袭性真菌感染的诊断标准,欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组（EORTC/MCG）（2008修订版）宿主因素临床表现微生物学依据脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原阳性确诊半乳甘露聚糖（GM）试验、G试验临床诊断组织病理依据,早期诊断,GM试验检测的是半乳甘露聚糖，主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断，是曲霉菌特有的细胞壁成分，当菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。GM试验检测早于临床症状和影像学判断【1】：可比侵袭性曲霉病(IA)临床症状平均早5-8天；比高分辨CT扫描平均早7.2天；比开始经验性抗真菌治疗平均早125天。,【1】PazosCetal.JClinMicrobiol,2005,43:299-305,为临床用药提供依据,不同病原感染在临床用药方面的差异,曲霉菌:伏立康唑,伊曲康唑,卡泊芬净,两性霉素-B等念珠菌:白色念珠菌:氟康唑;非白念:伏立康唑或卡泊芬净;卡氏肺囊虫:复方新诺明、卡泊芬净毛霉菌:目前只有两性霉素-B,2012年卫生部对抗菌药物分级管理政策,非限制使用级，如：青霉素，苯唑西林氟康唑限制使用级，如：哌拉西林/他唑巴坦伏立康唑特殊使用级，如：亚胺培南卡泊芬净,2012年“专项整治”重点内容,非限制级抗菌药物使用前送检率30%限制级抗菌药物使用前送检率50%特殊级抗菌药物使用前送检率80%,GM试验是真菌送检项目之一，对控制抗菌药物滥用有重要意义。,评价疗效和病情监测,GM释放量与菌量成正比，可以反映感染程度，动态监测血清GM水平的变化有助于判断抗真菌治疗的效果。在治疗期间,如果病人GM持续阳性或保持较高水平则预后差。GM抗原清除早的病人预后好，提示连续的血清GM检测能够监测病情变化。,不同患者BG()andGM()体液变化情况,GM试验与疗效评价,GM抗原含量随着抗真菌药物的使用逐渐降低,GM试验原理及使用方法,半乳甘露聚糖（Galactomannan，简写GM）是曲霉菌细胞壁上的一种多聚抗原，其包含了甘露糖骨干与半乳糖旁基的多糖，更准确的一点来说，是直线状（1-4）-D型甘露糖骨架于它们6-连接点连接到-D型半乳糖的多糖，即1-6-连结的-D型吡喃半乳糖。,曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测（GM试验）,获得欧盟CE认证获得国家SFDA认证,一、酶联免疫吸附测定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)技术是以抗原、抗体的特异性结合反应为基础，将抗原或抗体的检测与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的免疫检测技术。二、按反应方式的不同，ELISA实验的方法分多种。本次推出的真菌抗原和抗体检测产品分别采用了竞争法和间接法。三、ELISA试验的操作过程由样本处理、加样、孵育、洗涤、显色、终止等几个基本环节组成。各环节的具体要求因产品而异。,ELISA的基本原理,本公司使用竞争ELISA法，其原理是标本中的抗原和酶标板上包被的固相抗原均与试剂中半乳甘露聚糖抗体结合。标本中抗原量含量愈多，与试剂中半乳甘露聚糖抗体结合越多，剩余的抗体与包被抗原结合的越少，抗原抗体结合物与酶标抗体结合的越少，最后的显色也愈浅。标本和试剂反应后所产生的OD值与标本中待测定的GM含量成反比关系。通过标准曲线，便可以从反应显色的OD值上计算出待测标本中GM的含量。,曲霉菌半乳甘露聚糖检测（GM试验）试剂盒使用方法,一、实验前准备二、样本处理三、样本混合四、样本转移五、洗涤六、加酶标抗体七、洗涤后显色八、读数,开展GM实验需具备的基本条件,单道及多道移液器高速离心机酶标仪（450nm波长）恒温培养箱,GM试验必需仪器设备1.酶标仪：必须能使用450nm波长用于检测。2.高速离心机：必须达到10,000g离心力以上，一般迷你离心机达不到这个离心力的要求。如果离心机不能制冷，可在样本经沸水浴处理之后室温冷却15min再离心。3.37恒温培养箱（或其他可替代的恒温空气浴设备）：必须设置温度为37，其他温度（如35）不可以使用，否则会影响检测值，同时要保证恒温箱的洁净。4.沸水浴：一般的电磁炉或者其他可以保证沸水浴的设备皆可，但暂不推荐干浴5.漩涡混合仪,GM试验必需器具及耗材1.100L和300L多道移液器（排枪）及配套吸头：可以减少不同孔的加样时间差。如果使用洗板机，无需用300L多道移液器。2.100L和1000L单道移液器及配套吸头3.配制洗液的量筒和保存洗液的试剂瓶4.混合板：必须用厂家标配的混合板，可以有效地缩短转移时间5.加样槽：每种试剂使用专用加样槽加样，使用后清洗干净。6.封板膜：需用户根据每盒试剂做实验次数自备一部分备用7.浮漂：沸水浴使用,数据处理软件厂家提供的配套数据处理软件,推荐耗材：带锁扣的离心管：密闭性强，可以有效防止沸水浴时，EP管因加热而导致盖子弹开和引入污染。也可以用普通离心管代替，但是注意离心管内液面低于管外液面3mm左右即可，以保证沸水浴时管盖不弹开。,选配仪器：微孔板孵育/振荡器，洗板机，全自动酶免分析仪,推荐设备：酶标仪：Bio-Tek：Elx808IU,Thermo：MultiskanFCwithincubator,Tecan：sunriseRC2.洗板机：Bio-TekElx50,GM实验操作流程,混合,转移,加酶标抗体,显色,终止,样本采集与保存,一、试验前准备,产品全貌,浓缩洗液20倍稀释，配制洗涤工作液,取出酶标板，根据需要拆分板条,二、样本处理,100L处理液,取300L血清,+,二、样本处理1.沸水浴3min,二、样本处理2.10,000g离心10min,三、样本混合,60L样本+60L抗半乳甘露聚糖抗体,水平震荡混匀后，37温浴30min。,四、样本转移,将混合液转移至酶标板,贴好封板膜，37温浴30min。,转移时各反应孔一一对应！,五、洗涤3次,先甩尽孔中液体,然后在吸水纸上拍干,b.静置40秒，甩尽孔中液体,c.在吸水纸上拍干,a.每次每孔加入300L洗涤液,重复此操作3次（可使用洗板机完成）,a.每孔加100L酶标抗体,b.贴好封板膜,c.37恒温30分钟,六、加酶标抗体,七、洗涤后显色,洗板3次加显色底物加终止液并用酶标仪读取OD450值,洗涤3次后每孔加100L显色底物,37恒温15分钟后，加入终止液（50L/孔）,450nm波长下读数,注意事项（1）,4.洗涤操作时每孔的加样量应保持一致，拍板时应确保孔内无明显液滴残留。,1.使用移液器时排液不宜过快，防止溅出孔外，也不宜过慢，以免增大不同样本反应时间的差异（用户一定要使用多道移液器加样；推荐使用抗原检测产品配套耗材混合板）。,2.处理样品时应沸水浴，否则将影响结果。,3.严格按说明书要求控制孵育过程的温度及时间，不能随意变动。,试剂、血液样本应在适当的温度下保存，并避免反复冻融。为了防止污染，请使用洁净无菌的吸头。配制洗液时要混合充分，并使用无菌去离子水或超纯水。不能使用洗瓶洗涤酶标板。试剂盒组分使用前请先取出30min，平衡至室温。使用校验合格的移液器，移液器与吸头请契合紧密，确保移液精准。试剂盒中TMB底物溶液（R9）易氧化，尽量缩短开盖时间且避免强光照射，若溶液颜色变为浅蓝色时（正常使用时应为无色），应弃用。终止液具腐蚀性，易发生灼伤，在操作时请注意人身安全。各产品同时使用时，除浓缩洗液及终止液外，请勿将同一名称试剂互相替代使用。,注意事项（2）,阴阳性判定,阳性：GM0.95g/L阴性：GM0.75g/L灰区：0.75GM0.95g/L，建议连续多次检测并应结合临床资料综合评价,质量控制,R2a：试验OD值控制在1.00.3；R2e：试验OD值控制在0.50.2；空白对照：试验OD值控制在0.1以下。标准曲线：r20.98如果没有达到上述指标，则影响分析的可靠性，检测结果不予报告，需重新检测。,Bio-Enoche,第一步：整理原始数据并复制1.将所有原始数据粘贴到EXCEL单元格内。2.选定区域后复制单元格,复制区域,数据处理,第二步：粘贴到软件的计算窗格内在软件初始界面直接点击“粘贴”即可。,第三步：选择计算条件请从“请选择检测试剂盒的类别”处选择“曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒”，出现如下所示画面：,第四步：拟合曲线点击“回归/拟合”，得到拟合好的曲线。“直线拟合”得到的曲线如下：,第五步：计算样本中的抗原浓度并判断阴阳性点击“返回数据按钮”，出现如下画面：,第六步：数据保存、打印点击保存数据按键，出现保存成功提示，之后点击查询键，出现打印页面,第八步：数据清场、退出软件点击清空键清除数据，之后点击退出键退出软件,造成GM实验假阳性的因素主要有：（1）半合成青霉素，如哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸（2）与其他细菌或真菌成分交叉反应（3）肠道中定植的曲霉释放GM进入血液（4）谷物食物中存在GM（如大豆），通过受损肠粘膜进入血液（5）接受白蛋白、免疫球蛋白和其他营养液治疗（6）血液透析（7）接受心肺旁路手术（8）自身免疫性肝炎等免疫性疾病（9）新生儿和儿童（FP83%，与双歧杆菌交叉反应）,52,GM试验干扰因素,造成GM实验假阴性的因素主要有：（1）抗体多，抗原被抗体中和（2）释放入血的半乳甘露聚糖不持续，而很快被清除（3）抗真菌药物使用（如两性霉素B、三唑类药物），抑制菌丝生长从而减少GM分泌（4）局部感染，包括慢性肉芽肿（5）菌丝少，侵血管性弱（6）非粒细胞缺乏患者,曲霉不同种，GM释放量不同，因此在检测结果上也有差异：烟曲霉和黄曲霉GM释放量偏低；土曲霉、黑曲霉和构巢曲霉GM释放量较高。,GM试验的临床应用,表1GM试验结果判断及临床意义-诊断值血清（cutoff）临床解释-阴性值GM0.75g/L如果无宿主因素和临床表现可排除侵袭性曲霉菌感染阳性值GM0.95g/L如果有宿主因素和/或临床表现可诊断侵袭性曲霉菌感染，如无宿主因素和侵袭性曲霉菌感染临床症状，则不能诊断灰色区间0.75GM0.95g/L结合临床和其他曲霉菌检查综合评判，并需动态观察-,检测结果的解释,2.多数临床指南和专家认为：GM试验连续两次检验阳性才被认定为具有诊断价值。3.GM试验仅是综合评价中的指标之一,表227项GM试验诊断侵袭性曲霉病（IA）荟萃研究结果1-研究对象敏感度特异度-确诊的IA77%81%确诊或拟诊IA69%93%骨髓移植患者82%86%恶性血液肿瘤患者70%92%实体器官移植患者22%84%-结论：推荐GM试验用于恶性血液肿瘤和骨髓移植（HSCT）患者IA的筛查，而不推荐用于实体器官移植（SOT）患者IA的筛查。1PfoifferCD,etal.ClinInfectDis,2006,42:1417-1727,如果将G试验和GM试验联合检测，有助于真菌属的鉴别：表3G试验和GM试验联合检测的意义-种属G试验GM试验-念珠菌属+-镰刀菌属+-隐球菌属-/可有假阳性曲霉菌属+青霉素/拟青霉+-/可有假阳性接合菌纲-,文献报道1G试验和GM试验联合检测可提高诊断的阳性预期值和阴性预期值，保证诊断的可靠性（资料来源于对78例病人的分析）：表4抗原检测组合对诊断IPA的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值-抗原检测组合敏感度（%）特异度（%）阳性预测值（%）阴性预测值（%）-G2次88（28/32）64（21/33）58（23/40）92（35/38）GM2次72（23/32）91（30/33）89（32/36）78（33/42）G1次+GM1次84（27/32）88（29/33）87（45/52）88（23/26）-1徐金富,李惠萍,瞿介明.两种抗原联合检测对诊断侵袭性肺曲霉病的诊断价值.中华结核和呼吸杂志,2009,32(9):709-710,典型病例男性59岁因急性粒细胞白血病和肺炎住院。由于诱导化疗后中性粒细胞减少到0.45109/L，出现持续性高热，肺炎加重（见图6）。G试验结果：271pg/ml，GM试验结果：1.67（定性法，参考范围0.5）。肺组织活检见图所示。确诊肺烟曲霉病。,图5患者x胸片显示右肺致密阴影图6肺组织镜检可见烟曲霉,近年来COPD并发侵袭性肺曲霉病（IPA）病例报道逐渐增多。COPD并发IPA原因和发病机制尚不明确。Guinea等1研究发现入院前3个月或入院至分离出曲霉时累计使用激素700mg强的松、入住ICU、慢性心衰、在入院前3个月曾接受抗生素治疗是COPD并发IPA的独立预测因素。机械通气、侵入性操作和低白蛋白血症也可能与之有关2。1GuineaJ,Torres-NarbonaM,GijonP,etal.Pulmonaryaspergillosisinpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease:incidence,riskfactors,andoutcome.ClinMicrobiolInfect,2010,16:870-72许虹，袁伟峰，王露霞，等。慢性阻塞性肺疾病患者曲霉感染25例。中国感染与化疗杂志2010，10:143-146,研究都表明GM试验特异性较高，而敏感度波动较大（29%-100%）。Mennink-Kersten等认为1有以下几个原因。（1）曲霉菌生长和抗原释放与周围环境的营养条件和pH有关。如果营养充分，pH在7.5，真菌可持续生长并释放GM，但是当炎症发展时，真菌生长受到抑制，GM释放会减少。1Mennink-KerstenMA,DonnellyJP,VerweijPE.Detectionofcirculatinggalactomannanforthedeagnosisandmanagementofinvisiveaspergillosis.LancetInfect,2004,4(6):349-359,（2）与单克隆关联的抗原决定簇的暴露有关。单克隆抗