第一章蛋白质的结构与功能.ppt

蛋白质的结构与功能,第一章,StructureandFunctionofProtein,Protein来自希腊字母，意思是“头等重要的，原始的”蛋白质来源于对蛋清（清蛋白）的研究,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1833年Payen和Persoz分离出淀粉酶。1864年Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。19世纪末Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽。1938年德国化学家GerardusJ.Mulder引用“Protein”一词来描述蛋白质。,大事记：,1951年Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构-螺旋(-helix)。1953年FrederickSanger完成胰岛素一级序列测定。1962年JohnKendrew和MaxPerutz确定了血红蛋白的四级结构。20世纪90年代以后后基因组计划。,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。,1）酶的生物催化作用,二、蛋白质具有重要的生物学功能,2）调控作用,参与基因调控：组蛋白、非组蛋白等参与代谢调控：如激素或生长因子等,3）运动与支持,机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等,4）参与运输贮存的作用,血红蛋白运输氧铜蓝蛋白运输铜铁蛋白贮存铁,5）免疫保护作用,抗原抗体反应凝血机制,6）参与细胞间信息传递,信号传导中的受体、信息分子等,7）氧化供能,蛋白质的分子组成TheMolecularComponentofProtein,第一节,组成蛋白质的元素,有些蛋白质还含有少量的P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se、I等。,C5055%H67%O1924%N1319%S04%,主要元素组成,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点,凯氏定氮法：,一、氨基酸组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的基本氨基酸仅有20种,基本氨基酸中，除脯氨酸和甘氨酸外其余均属于L-氨基酸。,例外：,Pro亚氨基酸,Gly没有手性,非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,（一）氨基酸的分类,分类依据：R侧链基团的结构及理化性质的不同,甘氨酸glycineGlyG5.97,丙氨酸alanineAlaA6.00,缬氨酸valineValV5.96,亮氨酸leucineLeuL5.98,异亮氨酸isoleucineIleI6.02,苯丙氨酸phenylalaninePheF5.48,脯氨酸prolineProP6.30,非极性疏水性氨基酸,色氨酸tryptophanTryW5.89,丝氨酸serineSerS5.68,酪氨酸tyrosineTryY5.66,半胱氨酸cysteineCysC5.07,蛋氨酸methionineMetM5.74,天冬酰胺asparagineAsnN5.41,谷氨酰胺glutamineGlnQ5.65,苏氨酸threonineThrT5.60,2.极性中性氨基酸,侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷。,3.酸性氨基酸Glu，Asp,天冬氨酸asparticacidAspD2.97,谷氨酸glutamicacidGluE3.22,4.碱性氨基酸His，Arg，Lys,侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷。,组氨酸His（H）7.59,赖氨酸Lys（K）9.74,精氨酸Arg（R）10.76,另外：,1、蛋白质中的很多氨基酸是经过加工修饰的修饰氨基酸如：脯氨酸羟基化成羟脯氨酸赖氨酸羟基化成羟赖氨酸2、半胱氨酸Cys常以胱氨酸的形式存在,半胱氨酸,胱氨酸,（二）氨基酸的理化性质,1.两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectricpoint,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,2.紫外吸收,色氨酸和酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。,紫外分分光度法：大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,3显色反应茚三酮反应：氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm。该反应可作为蛋白质定性、定量分析的基础。,二、肽,（一）肽(peptide),肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽键(peptidebond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键，本质为酰胺键。氨基酸残基(residue):肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。,*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有方向性：,N端,C端,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二）几种生物活性肽,1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH有抗氧化剂的作用，可还原细胞内产生的过氧化氢,谷胱甘肽的生理功用：解毒作用：参与氧化还原反应：保护巯基酶的活性：抗氧化剂作用，维持红细胞膜的稳定：,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,三、蛋白质的分类,*根据蛋白质组成成分,*根据蛋白质形状,纤维状蛋白质：多为结构蛋白，难溶于水,球状蛋白质：多数具有生理活性，多数可溶如酶、免疫球蛋白等等,结合蛋白质及其辅基,蛋白质的分子结构TheMolecularStructureofProtein,第二节,蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系,蛋白质的分子结构包括（人为划分）一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure),定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。(包括蛋白质分子中所有的二硫键的位置）,二、蛋白质的一级结构,主要的维系键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素,三、蛋白质的二级结构,主要的维系键：氢键,由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。,蛋白质立体结构原则,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。,（一）肽单元,由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转,(二）蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋(-helix)-折叠(-pleatedsheet)-转角(-turn)无规卷曲(randomcoil),1.-螺旋：,-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象,结构特征：为一右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基,螺距0.54nm；螺旋以氢键维系（氨基酸的N-H和相邻第四个氨基酸的羰基氧C=O之间。氢键方向与螺旋轴基本平行）,2.-折叠,-折叠是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象,-折叠包括平行式和反平行式两种类型,结构特征：由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构；主链骨架伸展呈锯齿状；涉及的肽段较短，一般为510个氨基酸残基；借相邻主链之间的氢键维系。,3.-转角,是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,4.无规卷曲,（三）模体(motif),在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,螺旋折叠折叠2个His和2个Cys与Zn离子结合螺旋区与DNA结合,锌指结构,（四）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,四、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一）定义,肌红蛋白(Mb),为单肽蛋白质，含有153个氨基酸，有8个螺旋区,三级结构是蛋白质结构的基础对于单一多肽链的蛋白质，三级结构是它的最高级结构，只有具有完整的三级结构，才具有全部的生物学功能,（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。,（三）分子伴侣(chaperon),分子伴侣通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构.,*可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,*可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,*在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用,五、蛋白质的四级结构,亚基(subunit)有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基。,胰岛素受体：由4个亚基组成(22)，亚基与亚基形成单体(monomer)，2个单体形成二聚体(dimer)。,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,血红蛋白的四级结构,血红蛋白的四个亚基紧密结合，亚基之间的维系键是亚基之间的8个盐键,蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,从细胞色素c的一级结构看生物进化物种进化过程中越接近的生物，细胞色素的一级结构越相似,一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。,（二）一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,N-valhisleuthrproglugluC(146),HbS肽链,HbA肽链,N-valhisleuthrprovalgluC(146),由于单个氨基酸的变化引起血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,重要蛋白质氨基酸序列的改变可引起疾病,二、蛋白质空间结构与功能的关系,肌红蛋白Mb,血红蛋白Hb,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,*协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negativecooperativity),血红蛋白的四个亚基紧密结合，亚基之间的维系键是亚基之间的8个盐键,Hb未与O2结合的时候，Fe2+位于卟啉环平面外侧，与F8His连接，当第一个O2与Fe2+结合后，被拉到平面中，使得牵动F8螺旋片段，导致亚基之间盐键断裂、结合变松弛，使易于与第二个亚基结合,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,变构效应与协同效应,协同效应：一个亚基与其配体（O2）结合后，可影响寡聚体中另一亚基与配体的结合能力的现象称为协同效应起促进作用的，为正协同效应起抑制作用的，为负协同效应,别构效应：由于小分子（O2）与大分子（Hb）亚基结合，导致蛋白质分子构象改变及功能变化的现象称为别构效应。小分子物质，称为别构效应剂,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,第四节,蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein,（一）蛋白质的两性电离,一、理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI),当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,*蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷(电荷层）水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,变性蛋白质的性质改变：物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrinreaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,二、蛋白质的分离和纯化,（一）透析及超滤法,*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,*超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,PAGE,电泳结果,（四）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析