核酸分子杂交-七年制.ppt

核酸分子杂交,刘向华,（nucleicacidmolecularhybridization）,DEPARTMENTOFBIOCHEMISTRY与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应;与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等；非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉;具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。,常用的固相支持物：硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等,固相支持物的选择,良好的固相支持物应具备的条件：具有较强的结合核酸分子的能力（10g/cm2）与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应与核酸分子结合牢固非特异性吸附少具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作,常用的固相支持物硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等,1、硝酸纤维膜：是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的吸附作用，RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上在高盐浓度下，其结合能力80-100g/cm2吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上优点杂交信号本底较低缺点由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降对小分子量的DNA片段（200bp）结合能力不强靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移易破碎,2、尼龙膜：对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到350-500g/cm2。对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。真空干烤或紫外交联，核酸与膜以共价结合。优点吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）缺点对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针；杂交信号的本底也高。,3、PVDF膜（聚二氟乙烯）：与尼龙膜相似其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的离子反应，而比尼龙膜结合力更强且在预杂交中很容易被封闭杂交本底低结实耐用，可多次杂交。,2印迹方法Mechanicsoftransfer,虹吸印迹法（Capillary）真空转移法（Vacuum）电转移法（Electrophoretic）,BlotDNAtomembrane,CapillaryBlotting(upward)nospecialequipmentrequired!,1975年E.SouthernSouthernDNA印迹转移技术,DNA片段15kb，18小时,Electrophoreticblotting,不宜用硝酸纤维素膜,一般23小时，最多68小时,especiallygoodforsmallfragmentsresolvedbyPAGE,Vacuumblotting,3060分钟,moreefficientandquantitativethancapillarymustapplyvacuumevenlyandnottoostrongly,3印迹类型,Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交反向斑点杂交菌落或噬菌斑杂交,提取DNA,限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳,碱变性,转移到NC膜，高温烘烤,与DNA或RNA探针杂交,放射自显影,Southernblottinghybridization,检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因。可用于基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。,预杂交,PaperTowels,SouthernBlottinghybridization,tissue,SDS,ProtK,PhenolChloro,Spin,提取DNA,限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳,碱变性、转移到NC膜,与DNA或RNA探针杂交,放射自显影,Prehyb/Hybridization/Rinses,检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因。DNA指纹图谱,Southern印迹杂交的应用：,Northernblottinghybridization检测靶分子为RNA,RNA极易被RNase降解RNA酶抑制剂0.1%DEPC处理水(焦碳酸二乙酯),与Southernblottinghybridization不同之处：不需要限制性核酸内切酶酶切。变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。应用：检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。,Northernblottinghybridization,pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheart,muscle,GEFmRNA,Southernblottinghybridization,优点：简单、迅速（直接点样）；可在同一张膜上进行多个样品的检测；应用：同一种样品经不同倍数的稀释,可以得到半定量的结果；核酸粗提样品的检测效果也较好。,Dotandslotblottinghybridization将变性后的DNA或RNA直接点样与膜上,Reversedothybridization,直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同源序列。,DNAchip,Colonyorphagehybridization从重组DNA文库中筛选阳性克隆,二、核酸原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）,用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片中核酸进行杂交检测的方法。每张标本所用杂交液较少，20100l，为了避免杂交液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。,探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列在染色体中的精确定位；探针与细胞内RNA进行杂交，观察该组织细胞中特定基因的表达水平；用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进行杂交，确定有无该病原体的感染。,应用：,TheresultofFISHT