基因工程的基本操作程序2--公开课.ppt

,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？,双链DNA,不能,目的基因不能插入,载体上应有标记基因,可能造成基因丢失,分子搬运工载体,四环素抗性基因,氨苄青霉素抗性基因,人胰岛素基因,目的基因插入点,目的基因插入点,目的基因,人胰岛素基因,含有四环素的完全培养基,含有氨苄青霉素的完全培养基,死亡,死亡,存活,存活,死亡,存活,1.2基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,1、从基因文库中获取（序列未知）,2、利用PCR技术扩增（序列已知）,基因文库,基因组文库,部分基因文库如：cDNA文库,聚合酶链式反应,一、目的基因的获取,3、人工合成,(基因比较小，序列已知),反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA（化学合成）,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中获取目的基因,利用PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术。,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,人工合成法,（基因较小，核苷酸序列已知）,反转录法,化学合成法,二、基因表达载体的构建（核心）,1.目的,A.使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,B.同时使目的基因能表达和发挥作用,2.基因表达载体的组成：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,质粒,目的基因,限制酶,3.基因表达载体的构建过程,（1）用_切割质粒，使其出现切口露出_。（2）用_切割目的基因，使其产生_。,（3）将目的基因插入质粒的_处，加入_，形成了一个重组DNA分子,限制酶,黏性末端,同种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,三、将目的基因导入受体细胞-转化,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,稳定,表达,受体细胞,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,a.能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,b.Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,外源基因,（2）基因枪法,特点：成本高,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,（1）方法：Ca2+处理法（增加细胞膜通透性）,（2）微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,（3）过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,四、目的基因的检测与鉴定,检测（分子水平）:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:个体生物学水平鉴定,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,A方法:,DNA分子杂交,B过程:,1.检测,基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,(2)检测目的基因是否转录出了mRNA,方法:,分子杂交法,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原-抗体杂交,提取,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,2.鉴定（个体生物学水平）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,非编码区,非编码区,编码区,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,编码区,非编码区,非编码区,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码系列。即不含非编码区和内含子,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,过程：,a、变性（90-95）：双链DNA在受热下，_断裂，形成_,b、复性（55-65）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,方式：以_方式扩增，即_,条件：前提条件:_,结果：,指数,2n,短时间内大量扩增目的基因,已知基因的核苷酸序列,PCR技术扩增与DNA复制的比较,高温,解旋酶,体外复制,主要在细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,（3）人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,化学合成法、反转录法,蛋白质,mRNA,DNA,DNA,根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,生物某个发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组DNA,与载体连接,cDNA文库,反转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA文库的构建-逆转录法：,目的基因所在片段,CTTAA,G,CTTAA,G,CTTAA,CTTAA,G,G,PSt,运载体的特点3：,有标记基因,导入,接种培养,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌含抗四环素基因,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,导入,接种培养,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌含抗四环素基因,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,（便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。）,某种生物的全部DNA,限制酶,DNA片段,DNA片段与载体连接,重组DNA,基因组文库,导入受体菌中储存,基因组文库的构建,导入,接种培养,含有四环素的完全培养基,死亡,如何把导入了目的基因的受体细胞