临床检验中发光免疫.ppt

发光免疫分析的原理、优点及临床检验中值得注意的问题，北京大学健康科学中心研究员，中国生物物理学会光生物学委员会副主任，国际生物发光与化学发光学会学术委员会(ISBC)，国际生物发光学会科学科学委员会委员TBG总TBG-TT4，因此，K so，样品稀释n倍后， TT4k(总TBG-TT4)、相同，即FT4发光技术临床免疫分析划时代的进步，以促甲状腺激素(TSH)为例，第一代促甲状腺激素检测试剂盒，其正常放射免疫测定灵敏度为1-2mU/L，几乎不能检测低于正常值下限的血清TSH。 0.1-0.2毫微克/升的固相放射免疫测定灵敏度已开始在甲状腺功能亢进症的诊断中发挥作用。第二代促甲状腺激素检测试剂盒的发光免疫灵敏度为0.01-0.02毫安/升，已成为甲状腺功能亢进症诊断的首选指标之一。新的发光免疫功能的灵敏度为0.001-0.002毫安/升，更新了一些临床概念，改写了甲状腺功能调节理论。第三代TSH检测试剂盒、第四代TSH检测试剂盒、目前商用发光免疫分析产品的几个特点大多是全自动工作模式，有些是带微孔板的半自动，大多涂有磁性或非磁性颗粒以增加表面积。为了缩短反应时间，使用内置标准曲线加校正方法生成工作曲线。部分产品采用流动池测量法(适用于闪光发光或电化学发光)，流动池检测法示意图，检测器，检测池，负压泵，废液，四通阀，冲洗液，采样管，计量泵，干燥空气，原位注射泵，氧化剂，优点：结构简单，运行成本低的缺点：易交叉污染，工作效率有限，标准化自动免疫分析系统对试剂盒的技术要求，对仪器的要求：结构简单，运行效率高，故障率低，维护成本低。试剂盒的相应要求：标准化、集成化和简单化，具体为：一致的反应/洗涤/测定条件；操作步骤少，趋于一致反应时间短；重新优化了统一的标记/检测系统；统一了反应/洗涤/测定条件和操作步骤；以改变涂布模式、颗粒涂布、反应效率和反应时间。间接镀膜的散射干扰和离子干扰磁珠：反应效率和反应时间散射干扰和检测效率注意内源性物质的干扰！(生物素-亲和素系统)颗粒间接包被：间接包被夹心法原理、包被、待测抗原、间接包被、标记抗体、捕获抗体、特性：所有试剂盒采用相同的包被和结合配体、结合配体、工作曲线的特性和校正原理、工作曲线四要素的拟合方法：曲线基本形状的描述，取决于实验模式和剂量-效应关系的趋势。截距：描述曲线的位置，校正基于背景信号和系统误差，这导致曲线在校正后偏移。斜率：描述曲线的俯仰角，校正依据是组合/反应/检测效率。校正会导致曲线旋转。变形因子：调整曲线形状(取决于抗体活性和特定干扰因子的变化)、信号强度(Y)、分析物浓度(X)、基本形状、平移、旋转、变形、常用拟合方法的属性及其参数的含义，X:分析物浓度；y:信号强度；Y0:零浓度样品的信号强度；非特异性结合信号强度(NSB)，美丽的拟合曲线决不是准确实验结果的唯一保证！固定/不固定质控血清是监测数据可靠性的主要手段！(谨防作弊软件)，商业化发光免疫分析产品使用中可能出现的几个问题，检测指标b正常值和临床意义的差异(单克隆抗体特异性好，干扰小，测定值低)不同厂家产品的测定结果一致性差(与国家标准不一致)。内置标准曲线与校正相结合的方法并不完善。有些产品不显示原始数据，也不能监控其准确性。免疫分析结果的干扰因素、温度、氧化剂、还原剂、光、磁场、金属离子、防腐剂、杂质、背景物质、结合蛋白(小分子的测定)、同一干扰因素对不同检测方法的不同影响、待测物质、包被(结合)抗体、放射免疫测定、放射免疫测定或发光、标记抗原、TBG、离心沉淀、洗涤和去除，以甲状腺素结合蛋白(TBG)干扰竞争法T3测定为例，信号结果、信号结果、 当使用商业发光免疫测定产品时，必须做好的几项任务是根据制造商提供的数据建立正常参考值系统。 阐明每种试剂盒的特异性和交叉反应，如小分子激素之间的交叉，以及胰岛素和C肽、胰岛素原、促卵泡激素、黄体生成素、绒毛膜促性腺激素及其自身前体或代谢物之间的交叉。充分利用现有的国家标准参考校准结果(注意防腐剂干扰)(可从国家药品和生物制品检验所或临床检验中心获得)建立多点质量控制(2-3点)来监控每个实验的准确性。尽可能避免干扰因素取样：清洁样品管(防止还原剂的干扰)，不使用酶抑制剂，将样品及时送至实验室：恒温，避免强光和强磁场，严格操作程序，及时维护和维修，正常参考意义和灰色区域的存在。如果测定结果在灰色区域(正常值上下限值内约20%)，则需要进一步跟踪检查。95%或99%、-20%、20%的最佳“正常参考值”是他们自己的基本数据，对于患者来说，最佳参考值是他们以前的测量数据，即他们自己的对照；因此，积累患者的基础数据非常重要。尤其是性激素、生长激素、胰岛素和其他具有周期性分泌或释放规律的激素。时间、卵泡刺激素、卵泡期、排卵期、黄体期、月经期、正常人平均变化规律、正常参考值范围、患者变化规律(无排卵高峰)、敏感性(真阳性率):真阳性病例的检出率，即=检出阳性病例数/检出阳性病例总数的特异性(真阴性率):阴性与真阴性病例的比率。 即=阴性结果数/正常受试者总数如果肿瘤筛查方法的指标达到理论极限，即灵敏度为100%，特异性为99%(正常值为99%置信限)，且肿瘤的发生率大多低于30%/100，000，因此当将其应用于正常人群的体检时，总阳性病例可能为：30 (100，000-30) (1-99%)=30，999.7 1030 其中，假阳性率=999.7/1030100%=97%多为假阳性！因此，筛选指标的意义在于对高危人群的早期预警，而绝不是疾病的诊断！改进方法是采用多厂家产品或多指标联合测定(艾滋病、肿瘤)系列实验：多项试验阳性前为阳性，假阳性(误诊)遗留，假阴性(漏诊)平行实验：一项指标阳性，假阳性(误诊),假阴性(漏诊)选择原则：分别全面分析和权衡误诊和漏诊造成的医疗、经济、社会和伦理风险。低发病率疾病的筛查指标是用于一般人群造成的巨大“混乱”。检验结果与临床不一致的原因是由于个体差异或存在未知的干扰因素，总有少数情况下检验结果与临床表现不一致，如操作失误、仪器故障、试剂失活等因素。一步夹心法的低测试值可能具有超前滞后效应、药物干扰和其他基础疾病，在消除这些因素后，进行重复测试或重复送样。用相同试剂盒的校准品A稀释，然后重新测试。及时与门诊沟通，结合医嘱做出综合判断。原因和解决方案。所有夹心法通常都有带有强信号的异嗜抗体。用小鼠血清稀释样品，找到拮抗剂的制造商。不同实验方法或同一方法的不同制造商的产品之间的测定结果和临床正常值会有所不同。在不同的实