分子细胞生物学培训班

临床科研设计和SCI论文策略,-RNA干扰技术的应用湖南省生物医学信息专业委员会长沙赢润生物技术有限公司,讲座提纲,一.科研选题及设计：以SCI为目标二.临床样本在基因功能研究中的作用三.RNA干扰技术在基因功能研究中的应用四.RNA干扰技术在发表SCI论文中的应用,一.科研选题及设计：以SCI为目标,SCI没有捷径，但是有小技巧和经验。阅读文献是基础，必不可少。他山之石，可以攻玉。参考前人的经验，获得自己的Idea。,如何选题,部位前人的经验：发现某基因在肝癌组织中表达增高，并有很多机制。我们的借鉴：拜读大作后，茅塞顿开。查文献后，确定在乳腺癌中尚无人涉及，于是，SCI处女作出炉：某基因在乳腺癌组织中表达增高。注：全身器官那么多，你只要看文献比较及时，比较多，不太晚，总能找到合适的方向。,药物前人的经验：发现辛伐他汀有某种作用，能够治疗某种临床疾病，且对其原理进行了研究，找到了相关基因。我们的借鉴：拜读大作后，联想到了阿托伐他汀，于是SCI处女作出炉：阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用机制。注：同一类的药物有那么多种，您完全可以换一种药物拿来做一下试试。,机制前人的经验：发现某基因具有抗氧化应激的作用。我们的借鉴：拜读大作后，联想到氧化应激在好多疾病的病理机制中都发挥作用，比如糖尿病肾病、糖尿病神经病变等等，于是SCI处女作出炉：某基因在糖尿病肾病中的作用。注：注意串联联想：基因机制临床疾病基因,上下游基因前人的经验：发现A基因具有某种作用。我们的借鉴：拜读大作后，联想到A基因的上游或下游基因是B基因，是否也有这种作用？于是SCI处女作出炉：B基因具有某种作用。注：需要一定的知识基础，但相对于机制来说简单一点。,家族基因或者相同作用的基因前人的经验：发现某种药物能够对TNF-产生影响。我们的借鉴：拜读大作后，联想到IL-6以及CRP都是炎症因子，有可能这种药物对IL-6以及CRP也有影响，于是SCI处女作出炉：某种药物对IL-6以及CRP的影响。注：有相同作用的基因有很多，注意联想。,如何设计自己的课题,不要把实验设计得过广。只要在一点上面做得稍微有深度就行了。不要用一个实验来证明N个结论，而是要用N个实验来证明一个结论-即使这几个实验都比较简单。做出深度，做出层次来。,二.临床样本在基因功能研究中的作用,确定目的基因和临床疾病之间的关系确定目的microRNA和临床疾病之间的关系通常是整个课题的起始,收集临床样本,RNA,DNA,Protein,microRNA芯片,基因芯片,组织芯片,RT-PCR或Real-timePCR,Western-blot,免疫组化,基因表达差异,确定目的基因,参考文献,microRNA研究,二.临床样本在基因功能研究中的作用,确定预研究的目的基因后，如何设计课题？基因功能研究的两方面：A.基因的过表达-基因表达上调；B.基因的RNA干扰-基因表达下调。两者相辅相成，互为佐证。紧贴临床疾病的基因治疗这一目的。,三.RNA干扰技术在基因功能研究中的应用,3.1靶位点的选择&shRNA序列设计3.2shRNA表达载体构建3.3筛靶：确定最有效的shRNA3.4转染或感染目的细胞，表达shRNA3.5检测或验证RNA干扰效果3.6RNA干扰回复实验3.7动物模型实验,RNA干扰实验流程图,寻找靶位点，设计干扰序列,确定靶基因,参考文献,收集标本，比较基因表达差异,参考文献或文库,设计全新序列,将shRNA片段装载至表达载体,转染或感染细胞，表达shRNA,普通质粒载体,病毒载体,检测或验证RNA干扰效果,外源筛靶,mRNA水平,蛋白质水平,细胞表型水平,动物模型,预实验：确定目的细胞质粒转染效率,包装病毒,体外法,体内法,RNA干扰回复实验,3.1靶位点的选择&shRNA序列设计,非常重要的一步！事半功倍or事倍功半？现有免费软件设计：成功率较低（30%左右）商业化软件或shRNA库：成功率高（75%以上）,YrbioshRNA库让您的RNAi实验有一个良好的起点！真正做到事半功倍！包含TRC、Ambion等多个组织或机构开发的shRNA库；针对人及小鼠数万个基因，每个基因提供35条shRNA；库中shRNA有效率高达75%！大部分shRNA干扰效率超过80%！,推荐,3.2shRNA表达载体构建,TRC原装进口shRNA表达系统优点：（1）原装进口产品，本公司未做任何改动。（2）既可当作普通shRNA真核表达载体使用，同时也是慢病毒包装系统中的穿梭载体，可以用来包装慢病毒。缺点：（1）载体上没有荧光标记。（2）慢病毒的生物安全性，对实验室条件要求较高。（3）载体拷贝数较低，测序比较困难。,赢润shRNA表达系统（1）shRNA序列数据依然来自TRC、AmbionshRNA数据库，质量有保证，靶位点成功率高。（2）您可以选择构建一条或者多条shRNA，灵活度高。（3）多种启动子，有荧光或无荧光，绿色荧光或红色荧光等可自由选择，能够更好地配合后续实验。（4）载体既可作为普通shRNA表达载体使用，亦可作为腺病毒或慢病毒包装系统的穿梭载体使用，以进行腺病毒或慢病毒包装。,3.2shRNA表达载体构建,mirshRNA表达载体,3.3筛靶：确定最有效的shRNA,内源筛靶、外源筛靶什么情况下采用外源筛靶？（1）目的细胞暂时不易得到；（2）目的细胞转染效率较低（小于60%）；（3）目的细胞需诱导才能表达靶基因；（4）目前尚无靶基因的抗体。,3.3筛靶：确定最有效的shRNA,由于上述原因，研究者可以在非常容易转染的的细胞株（即所谓工具细胞）中进行“RNAi有效靶点筛选”工作。常用的工具细胞有HEK293、CHO、NIH3T3等。如果您的目的细胞很容易转染，那么可以直接在你的目的细胞中进行siRNA筛靶工作。,3.4转染或感染目的细胞，表达shRNA,通过预实验确定目的细胞的质粒转染效率方法：实验室现有转染条件下，转染一荧光载体（例如pEGFP-N1）至目的细胞中，通过观察荧光，判断目的细胞的质粒转染效率。原理：影响细胞质粒转染效率的主要因素为：（1）细胞类型；（2）转染试剂及转染条件；质粒的影响因素很小。,3.4转染或感染目的细胞，表达shRNA,如果目的细胞质粒转染效率低（小于60%）：腺病毒载体：高转染效率、高表达效率、使用方便。约85%的基因治疗临床项目采用的均是病毒载体（其中将近一半使用的是腺病毒载体）。,腺病毒包装体系,Adeasy系统：利用细菌重组；重组率较高，病毒滴度低。Admax系统：Cre/loxP，293细胞内重组，同源重组率较低。Adeno-X系统：PI-Sce、I-Ceu酶切连接。BLOCK-iTAdenoviralRNAiExpressionSystem：Invitrogen，GatewayLR体外重组技术。重组效率高，快速简单，筛选方便；对感受态要求较高；载体较贵。,推荐,慢病毒包装体系,三质粒系统四质粒系统慢病毒表达载体、gag/pol、REV、VSV-G,慢病毒表达载体,4.5检测或验证RNA干扰效果,mRNA水平：RT-PCR、Real-timePCR蛋白质水平：Western-blot、免疫荧光细胞表型水平：Hoechst33258染色（细胞凋亡）；DAPI（细胞凋亡）；TUNEL（细胞凋亡）；MTT（细胞增殖）；流式细胞检测（细胞周期与凋亡）；细胞小室实验（细胞侵袭转移能力）,4.6RNA干扰回复实验,RNA干扰中的Off-target既脱靶效应由于序列同源性（1115个核苷酸）而引起的非特异性干扰。解决方案：设计、筛选23个有效的shRNA进行实验。或者做RNA干扰回复实验。,按照Nature的标准，一个严格的RNAi实验要有6个对照：（1）转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；（2）nonsensesiRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；（3）positivesiRNA对照（监控假阴性）；（4）技术重复对照（也叫off-target对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-targetcontrol，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的RNAi效应）；（5）rescue对照（RNAi之后做过表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明RNAi的特异性）；（6）全表达组扫描对照（转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。,如何进行RNA干扰回复实验,细胞：目的细胞质粒或病毒：shRNA表达质粒或病毒；目的基因过表达质粒或病毒方法：A.先干扰靶基因，再过表达目的基因（WT）；B.共转染：shRNA表达质粒或病毒目的基因（MT）表达质粒或病毒,推荐,3.7动物模型实验,体外法：先将质粒或病毒导入目的细胞，再将目的细胞导入动物体内。优点：易操作缺点：不能完全模拟天然环境体内法：直接将质粒或病毒导入动物体内。优点：环境更真实缺点：不易操作,推荐,四.RNA干扰技术在发表SCI论文中的应用,研究实例一：IF0.8研究实例二：IF3研究实例三：IF7.5研究实例四：IF4.7,研究实例一,影响因子：0.8分,Methods,shRNA,细胞系,MTT测细胞存活率,Western-blot,细胞小室实验检测侵袭转移能力,动物模型,免疫组化,统计学分析,Results,Western-blot：,细胞存活率：,细胞小室实验：,动物模型：,HE染色：,PCNA：,研究实例二,影响因子：3分,Methods,细胞系,动物,干扰载体,细胞处理,动物模型,动物处理,RT-PCR,Western-blot,免疫组化,TUNEL测凋亡,统计学分析,Results,研究实例三,影响因子：7.5分,Methods,Results,文章思路,eIF2B中一个亚基（epsilon），在TMEF细胞中特异性高表达，RNAi之后能够影响eIF2B的活性，影响蛋白合成，并降低细胞增殖能力（细胞生长曲线和克隆形成），裸鼠成瘤实验获得一致结果。随后，在MCF-7中用siRNA抑制eIF2B，可以抑制肿瘤细胞增殖。最后，在293细胞中将其过表达，发现细胞蛋白合成能力和增殖能力增强。这篇文章优势在于首先在模型细胞上发现基因功能，然后在肿瘤细胞上进行应用，并且进行了RNA干扰回复实验，表达抑制一正一反，互相佐证，以充分说明问题。,研究实例四,影响因子：4.7分,文章思路,1.在H1299细胞中验证LivinshRNA的干扰效率：mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平2.在目的细胞Hela细胞中进一步验证LivinshRNA的干扰效率：mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平3.研究发现，抑制Livin-可以诱导Hela细胞凋亡，还可以增强其对其它肿瘤治疗方式的敏感性。4.对3中的相关机制进行了探讨：Caspase-3、PARP。5.RNA干扰回复实验。6.为什么干扰Livin-和干扰Livin-对Hela细胞影响大不相同？对其机制进行了研究（酵母双杂交实验：Smac）。,Methods,细胞系,干扰质粒,基因过表达质粒,Methods,RT-PCR,Western-blot,TUNEL,双杂交,Results,总结及展望,1.基因过表达和RNA干扰是研究基因功能的两个方面，相辅相成，互为佐证。2.各种新技术的运用，各种资源的共享，将会使基因研究越来越简单，相关实验进行的越来越顺利。3.技术手段相差不大，关键是文章思路。4.充分利用临床搜集的标本，能够为文章加分。5.microRNA成为RNA干扰、疾病诊断方面的热门研究领域。,赢润生物