液相维修保养讲座.ppt

WatersConnectionsSM,HPLC常见故障分析及日常保养知识,HPLC的梯度系统,WatersConnectionsSM,能引起HPLC发生问题的潜在因素:机械方面,化学方面,环境方面,操作方面,保养方面工作环境:如电源及地线,湿度,灰尘,环境温度等;化学品:如溶剂质量,样品状况,色谱柱/保护柱状况等;机械方面:泵,进样器,检测器,在线过滤器,管路连接质量等;操作保养:正确的操作程序,完善地日常及定期保养;,WatersConnectionsSM,逻辑判断及处理观察现象,分析色谱图及相关参数,问题分类,寻求正确的切入点,从最易最简处如手;问题化学品环境机器*色谱柱/保护柱*电源*泵*溶液*地线*进样器*样品*温度*检测器*湿度*数据处理单元*清洁程度,WatersConnectionsSM,分析系统工作状况的最直观的表现:系统压力色谱图-基线峰形重叠谱图(重现性),WatersConnectionsSM,基线问题分析,WatersConnectionsSM,基线噪声流动相内含有空气-脱气处理泵有问题.如单项阀,梯度阀,泵杆及密封件的问题清洗或更换系统有漏液之处-检漏并处理检测池内有气泡-冲洗检测池或在检测池出口家适当反压,如接一段内径常0.009“的管子(此法只适用于UV检测器!)电噪声-去除噪声源,信号线屏蔽,检查系统接地状况检测器光源灯能量低-更换光源灯检测池污染-冲洗检测池,WatersConnectionsSM,基线周期性噪声绝大多数情况下是来源于泵的问题泵头内有气泡-流动相脱气,泵头排气(注意正确的排气方法)泵进出口阀有问题-清洗或更换阀组件柱塞杆有问题-更换柱塞杆及其密封圈溶剂混合不良-加装混合器电噪声-去除噪声源,非周期性噪声气泡-流动相脱气检测池内有气泡-流动相脱气,检测池后加适当反压系统有漏液之处-检漏并处理电噪声-去除噪声源,WatersConnectionsSM,基线漂移系统未充分平衡环境温度影响(尤其对示差,电导,电化学检测)-室温,柱温,检测池温度控制梯度系统-溶剂A于溶剂B的ABS值相差大-试用另种溶剂色谱柱污染或有其他组份被洗脱出-冲洗,直至基线稳定溶剂发生变化(如溶入气体或溶剂挥发)-氦气或脱气机脱气,溶剂瓶避光,密封(但要注意防止溶剂瓶内产生负压)系统有漏液之处-检漏并处理,WatersConnectionsSM,WatersConnectionsSM,基线周期性波动温度影响-环境温度及检测池温度控制.注意空调机的影响溶剂混合不良-加装混合器流动相脱气不良-流动相脱气供电电源的影响泵不良-检修处理,WatersConnectionsSM,基线有无规律的尖峰气泡-溶剂脱气电路接触不良-保证清洁,接线牢固,接点无氧化光源灯不良-检查处理电噪声-去除噪声源,WatersConnectionsSM,脱气方法在线脱气机脱气氦气脱气真空过滤脱气注意:溶剂应每天脱气,超声脱气注意事项：1.在加入改性剂前脱气溶剂2.氦气脱气只有在溶剂比例不变时比较好因溶剂或添加剂挥发会改变比例3.流动相应该天天脱气,WatersConnectionsSM,无样品峰未进样泵未工作漏液流动相或样品的问题柱子或保护柱的问题数据采集装置的问题或其与检测器连线的问题,WatersConnectionsSM,负峰组份的ABS值小于溶剂的ABS值气泡通过了检测池对RI检测器不一定是有了问题，很可能是正常的所有峰都是负峰-可能是检测器输出与数据单元连线极性接反,WatersConnectionsSM,峰形不好-如峰拖尾,峰分叉,出肩膀机械原因还是化学原因系统有不正常的死体积在线过滤器(INLINEFILTER)污染(通常会伴随有系统压力升高之现象)色谱柱污染保护柱(GUARDCOLUMN)污染溶剂不好或使用不对(包括流动相及样品溶解液)样品不好色谱柱不良-*溶剂的影响*流速变化率不可太大-操作上应注意*日常保养,检测池,为什么会得到变形的色谱峰,所有色谱峰都变形（变坏）？,Voids-highbackpressure,distortedand/ordoublepeaks,相似的变化,诱发原因,展宽是以下两种因素的综合结果：仪器/系统影响;色谱柱的影响;进样器连接管线进样器至色谱柱色谱柱至检测器接头及筛板检测池体积进样体积色谱柱本身死体积筛板阻塞,差的色谱结果注意：色谱峰高降低，峰宽加大.,良好的色谱结果,谱带展宽比较,谱带展宽体积与系统体积,死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时),注意滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路！,塔板数：柱效测定结果,塔板数是反映色谱柱及仪器性能状态的关键参数,色谱柱安装及连接好坏带来的影响,确保色谱柱适当连接确保螺钉和锥箍固定在合适位置,注：色谱柱接头连接不当产生死体积(Parker型锥箍与Waters接头连接),密封(连接)良好,(PEEK接头比较方便),死体积,KeystoneSLIPFreeRConnectors*,锥箍位置可根据需要进行调节,*AvailablefromWaters,方便使用的连接器,.009,.020,.040,注意：连接管线内径的差异！,管线内径对柱外谱带展宽的影响,连接管线对系统谱带展宽的影响,.009,.020,.040,样品谱带在管线内发生了扩散,注：过长的管线亦会造成较大的谱带展宽,实例：管线内径对柱效的影响在色谱柱与进样器之间使用不同内径的管线,J.Li,下图：柱效：4000用0.04内径的管路测柱效的色谱图,上图：柱效：1,1000用0.009内径的管路测柱效的色谱图,注：使用相同色谱柱,谱带展宽对分离度的影响ES-TIC,不正确的管线连接灵敏度降低仪器：QuattroUltima代谢产物研究,改善了管线连接更换了进样器与切换阀及质谱检测器之间的10个接头拆掉了内径0.005英寸的多余管线4英尺,灵敏度提高一倍代谢产物可以从尾部分离出来,使用某一用户的原有色谱系统,优化的系统,J.Li,系统性能考察-谱带展宽试验,仪器谱带展宽试验(不接色谱柱)将色谱柱从系统上卸下来，连接换上零死体积两通流速：1mL/min.用单波长紫外检测器测定。(notaPDA/DAD)用流动相稀释测试混合物使检测器产生0.5-1.0AUFS的响应(可以使用系统启动测试混合物，其中含有尿嘧啶、对羟基苯甲酸乙酯和羟基苯甲酸丙酯;Waters部件号：Wat034544)进样2到5uL上述溶液使用5sigma法测量峰高4.4%处的峰宽：谱带展宽(mL)=峰宽(PW,seconds)/60典型的LC系统谱带展宽体积应为100uL20uL微柱系统之展宽应小于20uL,系统谱带展宽试验:测量“峰”宽(系统中未连接色谱柱),测量峰宽(W)，将其换算成以L为单位的体积。因系统未连接色谱柱，故V接近于零。,注：随着色谱峰的加宽，谱带展宽加大，分离度亦下降,影响色谱峰形的化学因素,色谱柱毁坏溶解样品的溶剂不当色谱柱过载质量过载体积过载其它柱外效应采样速率时间常数,当上样量超过一定限度时发生注意峰起点提前,6.25ginjected,2,Minutes,分析规模上样量(6g)获得良好的色谱峰形,4,6,浓度/质量过载对峰形的影响,进样体积对色谱峰形的影响,色谱柱/体积过载,体积过载,注意：色谱峰起点相同,检测池,为什么色谱图中某个或一些色谱峰变形?,为什么得到一个或一些变形的色谱峰?变形谱带某一个样品组分与颗粒表面发生阳离子交换,一些色谱峰峰形很好，但某一个或几个色谱峰峰形差,此化合物因化学问题导致拖尾错误地选择了填料或流动相pH,这些色谱峰峰形良好,硅胶溶解,PH的影响传统硅胶基质填料的pH局限性,XTerra杂化填料宽pH范围,硅胶在水中的溶解(ppm),12345678910,240-220-200-180-160-140-120-100-80-60-40-20-0-,pH,SilicaSolubilityCurve,硅胶基质pH2-8聚合物基质pH2-12AtpH8硅胶溶解,流动相pH和色谱柱寿命,pH8导致传统硅胶键合相颗粒溶解，形成死体积,所有色谱峰都变坏(变形)溶解样品的溶剂不正确洗脱强度比流动相强,(Toostrong),较强溶剂,(Toostrong),STRONGERSAMPLESOLVENT,所有色谱峰都变形化学问题溶解样品的溶剂不当,溶剂强度强于流动相,碱性物质拖尾化学问题(色谱柱品牌/pH),Time(min),50,普通C18,现代C18,中性物质,碱性物质,中性物质,碱性物质,0,pH7,不同品牌色谱柱的硅醇基活性的差异,填装良好的色谱柱,良好的色谱结果,系统、色谱柱、连接状况皆可良好,色谱柱对峰形的影响-色谱柱塌陷,柱头有死体积-Channeling,填料塌陷,Voids-highbackpressure,distortedand/ordoublepeaks,色谱柱塌陷(存在死体积)(机械振动或高pH颗粒溶解),会导致所有峰都变形！,SeeAppendixformoreinformation,色谱峰形欠佳的其它原因,色谱峰形问题：展宽且拖尾的色谱峰色谱柱进口过滤器(筛板)部分阻塞卸下接头在线过滤器污染更换筛板保护柱污染更换保护柱或柱芯,WatersConnectionsSM,关注系统性能两个要点-峰保留时间(RT)重现性,峰面积重现性RT重现性不好-无规律变化:*流量不稳-气泡,漏液,泵*温度影响有规律的变化,且逐渐趋于稳定:系统未充分平衡RT重现性好,但峰面积重现性不好-*进样量-选用定量管进样时,进样体积应大于3倍定量管容积;*样品,气泡;*样品在流动相各组份中不能充分溶解(通常伴随有柱压逐渐升高且经反冲后,柱压会恢复正常之现象);*基线噪声的影响;*积分处理的影响;,WatersConnectionsSM,工作环境的影响电源-容量稳定性地线-系统统一电源,统一接地清洁-不要轻视灰尘的影响湿度-特别是近海地区温度-空调机的影响,保留时间重现性,重现性流动相比例温度pH离子对,峰漂移平衡固定相稳定性色谱柱污染疏水塌陷有机相低于5%,温度对保留时间重现性的影响,增加温度降低保留温度每变化1，保留变化1%到2%选择性漂移(通常较小),300C,500C,600C,400C,温度的影响(等度分离),1920psi,反压,温度的影响(等度分离),较高温度的益处：*缩短运行时间*改善灵敏度*获得较为尖锐的峰形,N*降低色谱柱反压(流动相的粘度减小)*不同的选择性,26.5,23.5,温度的影响,30C,40C,50C,1Triamterene2Althiazide3Bumetanide4Benzthiazide5EthacrynicAcid,影响较小，但由温度变化可获得有明显的选择性变化.有助于对选择性的细微调节,Column:XTerraMSC183.5m,4.6mmx50mmMobilephase:25%MeOH,65%water,10%ammoniumbicarbonatebuffer,pH9,Wagrowski,Tran,保留时间变化,有些色谱峰保留时间变化,化学问题色谱柱类型不对(CNvsC18)pH流动相中有机相比例不对，或有机溶剂类型不对。,溶剂(有机相)组成对保留时间重现性的影响,溶剂组成每变化1%，保留时间变化5%到15%on在含有大量水相为流动相时，键合相塌陷,等度色谱-溶剂组成变化，保留时间变化,1,2,3,4,有机相比例高-运行时间短,有机相比例低-运行时间长,PH对保留时间重现性的影响,中性物质：无影响酸性物质：pH增加，保留降低碱性物质：pH增加，保留提高0.1pH的变化会导致高达10%的保留时间变化.,注：色谱填料颗粒，温度及有机相比例保持恒定,pH是方法开发中选择性调节的有力工具。pH控制可能是关键因素,pH,0.1,1,10,100,0,2,4,6,8,10,12,14,log(k),Acid(Un-ionized),Neutral,Base1,SilicaC18pHlimits,XTerra,Base1+2(Ionized),Acid(Ionized),Base2,Un-ionized,反向模式,B1,N,A,B2,pH5.5,pH6.0,流动相pH对保留因子的影响(k)Reproducibility,色谱峰形良好，但有些色谱峰发生移动,不同pH,保留时间重现性,非色谱柱的影响：离子对试剂(己烷磺酸)保留在低浓度下，离子对试剂浓度增加，保留增加在高浓度下，离子对试剂的浓度对保留几乎无影响需要长时间的平衡由于固定相试剂吸附试剂(平衡可能需要使用多达500个柱体积的流动相),使用离子对流动相的色谱柱-明显需要相对较长的平衡时间1mol/m2300m2/g2g(表面覆盖率)(硅胶表面积)(色谱柱中的填料量),*覆盖此色谱柱需要相当于600moles的离子对试剂*如果PIC试剂的流动相浓度是1mM/升，需要600mL溶剂*600minutes1mL/min*,离子对法的平衡,(10小时),鬼峰：来自样品的原因,样品溶解性用流动相溶解样品避免产生沉淀阻塞色谱柱或管线色谱峰变形样品中被测物的稳定性pH光(使用棕色瓶)温度时间/溶剂注意：*样品的问题可能与样品瓶相关,WatersConnectionsSM,某些意想不到的因素或不良的工作习惯会影响您的工作无线装置或于仪器同一供电线路中的高频设备及频繁启动的大功率设备可能会带来噪声干扰载液/气容器,实验器皿和器械的清洁实验器皿和器械的清洁不清洁带来干扰质量不良的化学品或使用不当(如滤膜)带来的影响实验前/后的准备和收尾工作.正确的开机/关机操作,WatersConnectionsSM,用户可自己作的日常检查系统压力检查:系统压力主要是柱压.若系统有不正常的高压,可分段检查,以判断故障来源;流量检查-用脱气的甲醇,泵后要有约1000PSI的反压进样器自动进样器洗针系统的检查2690/2695PLUNGERWASH及NEEDLEWASH的检查吸样针内是否有气泡同样进样量的重现性检测器开机自检(CALIBRATION)定期清洗系统-溶剂过滤头,泵,进样器,检测器清洗方法定期清洁系统-防/除尘.清洁电路时,需注意人身安全及防止静电损坏电路板,WatersConnectionsSM,溶剂更换的正确程序:用中间溶剂过度有机溶剂和盐类溶剂不准直接过度!,WatersConnectionsSM,溶剂过滤:选用合适的滤膜-脂溶性,水溶性,通用性过滤方式:过滤后混合,混合后过滤,510泵示意图,515泵示意图,7725i,717自动进样器,486光路示意图,2487光路示意图,示差检测器流路示意图,WatersConnectionsSM,2690/2695标准启动程序:1.溶剂管理系统的准备:启动-溶剂脱气-初始化密封垫清洗装置-初始化溶剂管理系统,WatersConnectionsSM,脱气启动脱气机前一定要保证脱气机真空腔内充满溶剂.使用DRYPPIME使所有真空腔内充满溶剂,WatersConnectionsSM,启动柱塞杆密封垫清洗系统作用-柱塞杆密封垫清洗液可润滑柱塞杆及其密封垫并冲去溶剂或盐类沉积物,起到保护柱塞杆及其密封垫的作用;清洗液的选择-对反相色谱,选用80%水及20%甲,或80%水及20%乙腈;步骤-*在MAIN屏幕内按DIAG键;*取下柱塞杆密封垫清洗液管入口端的过滤头;*注射针管充满清洗液并接于清洗液管入口端;*按PRIMESEALWSH键,START,推注射器;*当清洗液充满清洗系统后,按HALT键;*装回过滤头,将清洗液管置于清洗液内;*按CLOSE返回;,WatersConnectionsSM,DRYMRIME什么情况下作DRYMRIME-溶剂管理系统的管路是干的或者有空气存在;操作步骤-*将注射器插入启动/排气阀中,反时针旋转扭1/2圈,打开阀门;*在2690/2695屏幕进入DRYMRIME;*选欲作PRIME的管路;*抽动注射器,直至溶剂充满管路;,WatersConnectionsSM,WETPRIME什么情况下作WETMRIME-溶剂管理系统的管路中含有液体,并且要更换储液瓶和溶剂时;注意:只有溶剂管理系统的管路中含有液体时才可作WETPRIME;操作步骤-*进入2690/2695DIRECTFUNCTION*选WETPRIME,按屏幕指示操作;,WatersConnectionsSM,平衡脱气机操作步骤-*在STATUS屏幕输入要运行的初始溶剂组成;*将DEGASSERMODE的参数设为CONTINUOUS;*在DIRECTFUNCTIONS菜单中选WETPRIME,按比例ENTER;*输入0.000ML/MIN,定时为10分钟;.,WatersConnectionsSM,2690/2695标准启动程序:2.样品管理系统启动-初始化进样针清洗装置-冲洗样品管理系统什么情况下作冲洗样品管理系统-*初始化溶剂管理系统;*更换溶剂;*进样器针管内发现气泡;*每天开始使用2690/2695之前;注意:为避免盐类析出,当从缓冲液换为有机溶剂时,应使用中介溶剂,入如水.操作步骤-*按MENU/STATUUS键以显示CONTROL屏幕;*在COMPOSITION栏中输入相应的溶剂组成;*选PURGEINJECTOR,按屏幕指示操作;注意:初次启动该系统时要使COMPRESSIONCHECK框空白,以免作压缩检测.在密封件调整之前不可作压缩检测.,WatersConnectionsSM,启动针清洗系统作用-保持进样针的清洁,避免进样之间的样品交叉污染.同时,还清洗了进样针,从而保护了进样器密封垫.清洗液的选择-色谱条件清洗液缓冲液,反相90%水及10%甲醇非水溶液,反相100%甲醇正相流动相GPC流动相离子交换水步骤-*在MAIN屏幕内按DIAG键;*按PRIMENDLWSH键.可重复多作几遍;,疏水塌陷(流动相中有机相比例低时发生),当使用有机相比例较低的流动相（极性较高的）时，观察到保留完全丧失的现象使用100%水溶液流动相，进样77针，运行时间超过20小时，保留时间皆比较稳定但当停止流速后，再开机时，保留丧失。此现象表明：当色谱柱卸压时，流动相被排出孔外,?,40min,40min,Vo,未湿润的孔,湿润的孔,注意：保留性质与填料表面积与配体密度有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的保留特性即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！,低有机溶剂或纯水溶液流动相被排出孔外,C18硅胶,什么是“疏水塌陷”？,为什么卸压会导致色谱柱疏水塌陷可能机理,停止输液时，迫使水相流动相进入孔中的压力降低为零。压力降低时，疏水的孔表面会排斥极性流动相，使孔中“dewet”thepore.,当带有压力的流动相流过填料时，孔被浸润,停止流速，流动相无压力孔中液体被排出(de-wet)-重新升流速孔仍未被浸润样品不能进入孔中导致被测物无保留。(需要40%MeOH重新浸润孔。),注：带有内嵌极性基团的配体不会发生疏水塌陷现象,被测物无保留,被测物保留适当,重新浸润脱水的固定相:,使用含有40%以上的甲醇或其它极性有机溶剂(浸润所需其它有机溶剂的比例(%)可能变化)通过降低接触角来达到浸润目的不要试图用压力迫使水溶液流动相重现回到孔中不实际，因色谱柱出口在