生物安全防护铭传大学.ppt

生物實驗室安全防護須知,銘傳大學生物科技學系張猷忠,生物實驗室安全防護目的,保障人身安全保障操作者本身的安全維護實驗室其他成員的安全保障實驗室外其他第三者的安全避免環境污染避免造成實驗室內環境的污染含儀器，如冰箱、離心機、微量分注器等實驗桌、門把及實驗室地面等避免造成實驗室外環境的污染如動物飼養場、河川、魚、土壤、植物或作物等,生物實驗室的危險來源,所操作的生物及微生物如病毒、細菌、真菌、寄生蟲和實驗動植物等。藥品和試劑如酸、鹼、致癌物、放射性同位素、毒性物質、易燃物質和危險氣體等。儀器設備如高壓蒸氣滅菌鍋、離心機、紫外光觀察箱、高熱烘箱和電泳設備等。管理制度和人如生物感染性廢棄物的處理、儀器使用教學及維護、人員健康管理及監測等。在人方面，包括壓力調適、健康照護、情感處理、學術競爭、個人的責任義務和道德感等。,實驗室病毒感染實例,台灣(2003/12)、新加坡(2003/9)及中國(2004/7)都曾發生實驗室人員感染SARS事件：預防醫學研究所詹姓研究員是在卸下全身所有的隔離防護裝備後，才操作病毒器皿滅菌步驟，因突發狀況，且無安全防護裝備而感染。2005/3/26：流感病毒(H2N2)的實驗室感染。2005年2月美國病理學家協會發送含H2N2流感病毒的樣本。1968年以後出生的人，對H2N2病毒並不具有，或僅具有有限的免疫力，H2N2病毒也不包含在目前的三價流感疫苗中。培養分離新城病病毒(Newcastlediseasevirus)，造成大學教師及研究生感染結膜炎。1956年，前蘇聯某實驗室，9支裝有感染了委內瑞拉馬腦炎病毒鼠腦的安瓶被打破，幾天內就造成24名工作人員感染。,實驗室病毒感染實例,1979年，英國Birmingham大學的一起實驗室意外，造成天花病毒散播：兩個人感染，其中一人死亡。實驗室負責人也因此自殺。1961年，莫斯科實驗人員從流行性出血熱疫區捕捉到一些野鼠帶回實驗室。由於疏忽，這些野鼠被放在了室內暴露的場所。不久，實驗室有63人相繼出現發熱症狀，開始被誤診為流感，1周內又增加了30人，才開始懷疑到是流行性出血熱。1998年，中國西安某高校在使用大白鼠進行試驗時，有兩名學生被大白鼠咬傷，還有一些學生給實驗老鼠放血、解剖。在實驗過程中，這些學生均未按照要求戴手套操作：結果在29名實驗人員中，有9人感染了流行性出血熱。該病原會經由氣霧(Aerosol)傳染。,實驗室細菌和原蟲感染實例,北部某公立大學研究生感染研究中的題材，流產布氏桿菌(Brucellaabortus)。美國NIH曾發生Qfever(Coxiellaburnetii)實驗室感染，導致153人發病，其中1人死亡。2006/9/17：中部某大學發生實驗室博士班學生感染桿菌性痢疾(Shigellaflexneri)事件。2004年，該校另一間實驗室也曾發生登革熱感染意外。後果：實驗室被關閉。其他細菌之實驗室感染實例：肉毒桿菌(ClostridiumbotulinumtypeA)、沙氏桿菌(Salmonellaspp.)等。1986年的一次實驗操作意外，造成南部某學校實驗室助理感染弓蟲。幾乎與隱胞子蟲(Cryptosporidiumparvum)實驗有關工作者都會受到感染，尤其是以小牛下痢為卵囊來源時。證據顯示卵囊可能經由空氣傳染。,病原外洩的安全隱憂,操作或保存中的微生物外洩：引發人類疾病天花病毒(Smallpoxvirus)、炭疽桿菌(Bacillusanthrax)、肺結核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)等。前蘇聯斯維爾德洛夫斯克實驗室的洩露事故：1979年4月的一天，某陶瓷廠的一些工人來到醫院。他們的病狀是發燒、咳嗽、胸痛。第一批到醫院的病人病情迅速惡化。幾個小時以後，數人死亡。事後人們才得知，當地的生物武器實驗室曾發生了一次爆炸，約10公斤的炭疽芽孢粉劑洩露，爆炸釋放出大量的細菌毒霧，造成附近1000多人發病，數百人死亡。美國州立大學布氏桿菌病實驗室的一起布氏桿菌洩露事件，共感染了45人，死亡1人。造成動物傳染病最近案例：口蹄疫病毒(FMDvirus)由英國實驗室外洩。,病原外洩的安全隱憂,與外界病毒產生核酸重組流感病毒(Influenzavirus)、輪狀病毒(Rotavirus)、Norovirus等。與外界細菌交換遺傳物質抗藥性或毒素基因的散佈及交換。實驗動物攜帶病原：美聯社報導(2005/9/16)：大約在兩週前，三隻感染了黑死病細菌(Yersiniapestis)的老鼠，從一個實驗室裏不見了。1967年，歐洲的三個城市為研製疫苗，從烏干達等地進口了一批黑長尾猴，而這些猴子攜帶一種特殊的病毒，引起了13名工作人員患病，並使這種疾病在德國馬堡等地區流行，馬堡病毒(Marbergvirus)由此而得名。被感染人員散播病原台灣預研所SARS事件，當事人發燒後6天，始自行至診所、醫院看病，並曾到新加坡開會。後果：有70位新加坡人須被隔離，有20多名國人需作自我健康管理，被感染者差點沒命。,操作核酸外洩的安全隱憂,實驗室操作的核酸外洩：抗除草劑基因、抗殺蟲劑基因。仍在實驗中的轉基因作物或動物。重組病原核酸。毒素和抗藥性基因。,生物實驗之安全法規,國科會頒有基因重組實驗室守則同時考慮重組體及生物性安全防護國內持有、保存或使用第二級以上感染性生物材料單位，為落實實驗室生物安全自主管理，避免發生實驗室感染意外，應依法成立生物實驗安全委員會或指派專責人員，確實督導實驗室各項生物安全相關事項之執行，並依相關核備程序向主管機關申報否則依傳染病防治法第63條規定，可處以新台幣9萬元至45萬元之罰鍰。,生物實驗審查程序,生物實驗安全委員會第二級及以上危險群微生物之實驗，必需經由研究機構生物實驗安全委員會批准。需經由行政院所屬主管機構核准後方可進行之實驗選殖產生劇毒之基因將抗藥性基因殖入病原微生物人體試驗委員會(IRB,InstitutionalReviewBoard)有關醫學實驗相關的人體試驗及檢體採樣，須先經IRB審核批准。,基因重組實驗的防護,物理性防護層級(PhysicalContainmentLevel)物理性防護的目的是將重組體隔離在設施或設備內，防止實驗人員和其他物品受到污染，並且防止其向外界擴散。因封閉程度的不同，區分為P1、P2、P3和P4四等級。生物性防護層級(BSL：BiosafetyLevel)須同時考慮重組DNA載體及宿主系統之安全性；降低在實驗室外環境中，載體在其宿主中的存活力，實驗用宿主中的載體轉移到非實驗使用的宿主。分為BSL-1、BSL-2、BSL-3及BSL-4四等級或ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3及ABSL-4四等級。,生物實驗室分級,P1lab(BSL-1):可處理第一級危險群微生物之實驗室。通常這一類微生物與人類健康或成人之疾病無關。P2lab(BSL-2):可處理第二級危險群微生物之實驗室。在人類所引起的疾病很少是嚴重的，一般來說，傳染力有限，而且通常有預防及治療的方法。P3lab(BSL-3):可處理第三級危險群微生物之實驗室。在人類可以引起嚴重或致死的疾病，可能有預防及治療之方法。P4lab(BSL-4):可處理第四級危險群微生物之實驗室。在人類可以引起嚴重或致死的疾病，目前並無預防及治療之方法。,瞭解實驗室的生物性材料,要知道系上實驗室有使用到那些生物性材料。種類、來源、致病性、防護方法等。目前系上所保存的第二級危險群微生物(RG2)FungiAspergillusfumigatusVirusesNewcastlediseasevirus,Humanrotaviruses,Noroviruses,Astroviruses,HumanadenovirusesBacteriaStaphylococcusaureus,EscherichiacoliO157:H7,Salmonellatyphi,Salmonellatyphimurium,Salmonellacholeraesuis,Salmonellaenteritidis,Salmonelladerby,Salmonellapanama,Salmonelladublin,Vibrioparahaemolyticus,瞭解病原可能的感染途徑,空氣或氣霧傳播SARS,Flu,TB空調、不當的實驗或儀器操作、帶病工作。有無穿帶適當的防護設備，如口罩、實驗衣等。有無在合適的生物安全操作箱操作。不慎吸入黴菌孢子、真菌、細菌或病毒培養液。食物或飲水Salmonellaspp,pathogenicE.coli使用實驗用微波爐烹煮食物、食物放置實驗室冰箱。皮膚或黏膜接觸NDV,parasites污染桌面或門把、不良衛生習慣、實驗意外。器械感染如針頭和刀片。,生物安全等級第一級-BSL1orP1Lab-,包含標準實驗室操作適合對操作人員及環境無或低危害的物質RG1及一般標準重組DNA的試驗環境實驗室設施：(第二道防護)要有門與外界隔開，窗戶要裝設紗窗或屏障在建築物中，實驗室無需與主通道加以區隔工作通常在開放空間的操作台上進行工作桌面要易於清潔及不透水不需要特別的隔離設備，亦不常使用安全防護設施：(第一道防護)保護衣物：實驗衣、手套人員保護裝備：面罩、眼鏡或眼罩人員訓練要求：監督管理者：具有微生物或相關學科的一般訓練實驗室人員：具有實驗室操作流程的特定訓練,P1級實驗室-實驗實施要項-基因重組實驗室守則規定-,進行實驗時，宜關閉實驗室的門窗。每日實驗結束時需滅菌實驗台，如實驗中發生污染，需立即加以滅菌。實驗所產生之所有生物材料廢棄物，在丟棄之前需滅菌。被污染的器具需先經滅菌後，再清洗使用或丟棄。不得用口做吸量操作。實驗室內禁止飲食、吸煙及保存食物。操作重組體之後，或離開實驗室之前要洗手。在所有操作中，應儘量避免產生氣霧。要從實驗室搬離被污染物品時，必需將其放入堅固且不漏的容器，在實驗室內密封後才可運出。防除實驗室的非實驗用生物，如昆蟲及鼠類等。若有其他方法可用，應避免使用針頭。實驗用衣物的使用，需遵從計畫主持人的指示。需遵守計畫主持人所訂之其他事項。,滅菌及消毒,高壓蒸氣滅菌(Autoclave)滅菌方法：高壓蒸汽滅菌121，15p.s.i.，1540min適合所有污染物之殺菌滅菌指示帶、滅菌專用塑膠袋、滅菌用不銹鋼桶或盤紫外光滅菌無菌室或BSC使用前後，或污染區域照射至少30min70%Ethanolor50%Isopropanol皮膚或桌面和地面的污染次氯酸鈉(Hypochloride,高力士漂白水)120%稀釋液桌面和地面污染；器械、塑膠和玻璃器皿之殺菌處理中性肥皂或洗手乳洗手用,實驗室物品的清洗,一般玻璃器皿先以清潔劑（沙拉脫）浸泡刷洗，自來水洗淨，二次去離子水沖洗後，陰乾或烘乾備用有培養或污染病原微生物、或其他重組DNA實驗使用的微生物時，應先將器皿滅菌後，再清洗有沾染蛋白質的器皿，應在使用後清洗前，浸泡於含清潔劑的水中有沾染微生物或病毒的器皿，在使用後清洗前，應浸泡於含次氯酸鈉（漂白水）的水中,可能產生氣霧的原因,把燒熱的接種用白金環或接種針插入培養基，或燒熱的金屬板接觸生物性材料。以加熱法滅菌含生物性材料的接種環。以煮沸或微波來加熱生物性材料。用力排出吸管或針筒內之液體。快速吸排微量分注器。搖晃含生物性材料的液體，讓液面產生泡沫。以離心機、均質機、超音波破膜儀、或真空乾燥機處理生物性樣本。使用Vacuumpump時。以Shaker或Roller培養生物性材料(旋轉速度過快時)。,微量分注器,Aspiratorbottlesorsuctionflasks,生物安全等級第二級-BSL2orP2Lab-,適合對人員及環境會造成中度危險物質的操作實驗室設施：(第二道防護)生物安全等級第一級實驗室設施，加上高溫高壓滅菌箱及沖洗眼睛設備實驗室要與公共區域分離，要有可以上鎖的門空氣流入實驗室不可再循環到其他非實驗室區域具有ClassI或II生物安全操作櫃安全防護設施：(第一道防護)依照生物安全等級第一級安全防護設施人員訓練要求：監督管理者：具有能力勝任相關責任實驗室人員：具有對病原的相關知識要有實驗室專用生物安全手冊視需要實施免疫措施及人員血清採集其不同點在於：工作進行中，不可進入工作場所。某些會造成感染性氣霧的操作，須在生物安全箱(ClassI或II)或其他隔離設施中進行。,實驗室沖洗裝置,全身淋浴沖洗裝置洗眼器沖洗裝置的日常保養勿把玩沖洗裝置,洗眼器,洗眼器,沖洗器,P2級防護實驗室-硬體要求-,實驗室除了具備跟一般微生物學實驗室相同等級的設備外，需設置生物安全操作箱(第一級或第二級)，且要做定期檢查。為了處理第二級危險群微生物，而使用容易產生氣霧的磨碎機、冷凍乾燥器、超音波細胞打碎機及離心機等儀器時，需把這些儀器放置在安全操作裝置中(第一級)。但若機器已經有防止氣霧外洩的裝置，則不在此限。實驗室需具備處理污染物及廢棄物滅菌用之高壓滅菌器，最好放置於同一房間，如有困難，則可置放於鄰近處。實驗室宜置有UV燈及雙重門，如無雙重門，則門必須為密閉式實驗室宜設有可用腳或肘操作或自動的洗手的裝置。若在此級實驗室內同時進行P1級的實驗時，需明確劃分實驗區域，小心進行操作。非基因重組的實驗，亦需明確劃分實驗區域。進行實驗時，須關閉實驗室的門窗。,層流清淨工作台-LaminarFlowCleanBench“-,HEPAFilter,HEPA(HighEfficiencyParticulateAir)filterfiltersparticlesto0.3micronsat99.97%efficiency.Whereparticulatessuchastoxicpowdersandfibersareofconcern,aHEPAfiltermaybeinstalled.,第一級生物安全操作箱-ClassIBiologicalSafetyCabinet-,TheClassIBSCprovidespersonnelandenvironmentalprotection,butnoproductprotection.,ChemicalFumeHood,第二級A1型生物安全操作箱-TheClassII,TypeA1BSC-,30%,70%,通常可分為一般生物性作業時使用之A型，及操作含有少量有害危險化學物質、放射性物質、氣體、致癌物質等HEPA過濾器無法有效捕集去除之物質之作業時使用之B型,下吹氣流0.5m/sec,第二級A1型生物安全操作箱,第二級B1型生物安全操作箱-TheClassII,TypeB1BSC-,70%,30%,30%,70%,下吹氣流0.5m/sec,第二級B2及B3型生物安全操作箱-TheClassII,B2&B3BSC-,TypeB2,TypeB3(A2),100%,30%,70%,下吹氣流0.5m/sec,排氣管路與氣室、循環管道需設計為負壓,第三級生物安全操作箱-TheClassIIIBSC-,負壓值通常約為0.124kPa,P4lab必備,防氣霧外洩的裝置,O-ring,上蓋,生物安全等級第二級-標準微生物操作程序-,依照生物安全等級第一級的標準微生物操作程序規定。實驗室入口必需貼有生物危害警告標誌，要有進出的規定及流程。操作第二級危險群微生物時，需戴手套以防污染，操作完畢後及離開實驗室前，需洗手或消毒。當處理高濃度、大體積、易潑濺或產生氣霧的感染病原時，必需在ClassII生物安全操作櫃內進行。針及尖銳物的預防措施：使用過的針頭應單獨放置於堅固容器內，不可丟棄在一般廢棄物容器內，或是以針頭銷毀器銷毀。不要用手接觸破碎的玻璃。若有液體濺灑或發生意外，應報告。,污染或可能感染的處理,立即報告老師。污染面除污、洗淨和消毒。脫下污染衣物，浸泡於10100X次氯酸鈉漂白水中至少30分鐘，再以洗衣機洗淨並烘乾。必要時，就醫觀察，並告知污染病原種類，或投予預防性抗生素。必要時，通知疾病管制局或動植物防疫檢疫局。,P2級防護實驗室-基因重組實驗室守則規定-,不得用口做吸量操作。若有其他方法可用，應避免使用針頭。實驗室內，要穿著實驗衣，離開前要脫掉。禁止對實驗性質不了解的人進入實驗室。實驗進行中，要在實驗室之入口，標示P2級實驗室，並掛上P2級實驗進行中的標示。而且保存重組體之冰箱及冷凍庫也要做同樣的標示。實驗室要經常清理，保持清潔，不得放置與實驗無關的物品。安全操作裝置內的HEPA過濾器，在更換前、定期檢查時及實驗內容變更時，需密封安全操作裝置，每立方公尺用10公克的甲醛燻蒸1小時，去除污染。需遵守計畫主持人或實驗室負責人所規定之其他事項。,生物性材料危害警告標誌,基因重組實驗室安全防護標誌,P1及P2級實驗室比較表,隔間P1:需要；進行實驗時宜關閉門窗P2:需要完善隔間；進行實驗時須關閉門窗，如果能裝置UV燈及雙重門尤佳，否則門須為密閉式。洗手設備P1:需要P2:需要(必須是能以足、肘或電子操作)安全操作裝置P1:實驗台(適當防污)，或用第一級安全箱櫃P2:第一級或第二級安全箱櫃(若同時進行P1級實驗，需明確劃分實驗區域)滅菌鍋P1:不一定需要(如果有需滅菌的廢棄物，請裝在滅菌袋，滅菌後才可丟棄)P2:需要(須在同一實驗室)標示P1:不需要P2:需要(含冰箱、冷凍庫),生物安全等級第三級-BSL3orP3Lab-,適用於有關會因吸入而造成嚴重致死的本土性或外來病原(RG3及RG4)的試驗，如臨床、診斷、研究或製造。實驗室設施設施：為獨立建築或單獨隔離的區域。實驗室要密閉，設置緩衝區及雙門，雙門設定不可同時開啟，而且應有更衣室的設計。實驗區域內需有廢水收集及滅菌之設備，高溫高壓滅菌箱需有雙門開啟(即穿牆式)。牆壁、天花板及地板需防水及易於清潔。需要密閉式供氣設備，單向氣流，空氣需向內流入實驗室方向(負壓)，每小時氣體交換十至十二次，廢氣不循環。具有ClassI、II或III生物安全操作櫃。人員訓練要求：實驗室人員對處理致病性及致死性病原需有特別訓練，並受具對此病原有關的操作非常熟練的研究人員的監督。視需要實施免疫措施，工作人員必須採集血清。所有感染性物質的操作，必須在生物安全箱(ClassI、II或III)中進行，工作人員亦須穿戴合適的防護衣。,P3級實驗室-實驗實施要項-基因重組實驗室守則規定-,基本實施要項同P1和P2級實驗室。進入此級實驗室需戴口罩、鞋套及帽套。實驗操作時，要使用實驗用手套。使用過之手套在作業完成之後，需在不污染其他物品的情況下脫掉，滅菌處理。實驗區域內所穿著之實驗衣需為長袖且胸前不開口，無鈕扣，從上向下套之形式。離開實驗區域時，需把實驗衣脫掉，滅菌處理後再行清洗。實驗區域需從緩衝室進出，禁止與進行實驗無關之人員進入。實驗進行中，要在實驗室及實驗區域之入口處，標示P3級實驗室，並掛上P3級實驗進行中的標示。而且保存重組體之冰箱及冷凍庫，也要做同樣的標示。,生物安全等級第四級-BSL4orP4Lab-,適合第四級危害性病原體之有關實驗工作。如P3實驗室規格。在實驗區域內需具備兩套以上之發電設備，以使在電力供給不足時，可維持負壓狀態。須於ClassIII的生物安全箱操作實驗，或ClassI或II的生物安全箱再配上一套具陽壓工作服的條件下工作。從第三級安全操作裝置及實驗區域要把生物試驗材料在活的狀態搬出時，必需放在堅固不漏的容器，並且要通過浸漬槽或是燻蒸滅菌室。搬入時需做同樣的處理。,實驗室成員安全管理,基本的生物和化學實驗安全訓練無菌操作技術訓練儀器使用訓練和儀器使用紀錄實驗物品清洗、準備、和滅菌訓練第二級及以上病原的操作防護訓練平時清潔維護工作必要時，得於實驗前及計畫結束後，採集操作者血清，並作抗體測試。必要時，得準備特定抗生素、抗病毒藥物、抗血清或疫苗備用。,管理制度的重要,前述實驗室感染個案醫療院所群聚感染事件竹東榮民醫院疑似發生退伍軍人病的群聚感染，其護理之家也發生Norovirus感染。反映了護理、看護人員的照護及衛生觀念有待加強。院內空調設施的清洗，熱水管路的消毒。振興醫學復健中心院內員工感染肺結核群聚事件。合宜且易於執行的管理制度安排合理的工作量，工作不宜太累。,儀器使用應注意事項,第一次使用前，須經資深人員講解，並詳讀使用手冊或接受訓練講習並考核通過：如超高速離心機、高壓蒸氣滅菌鍋爐、放射性儀器、電泳設備、蒸餾設備等。千萬不要只憑想像，或以往使用其他電儀器的經驗來進行操作。注意儀器使用的電壓及接地。使用前：注意儀器設定情形，和上次使用紀錄。使用後：復原設定(即歸零)，並紀錄使用情形。,實驗室常發生的意外,觸漏電意外地震：化學藥品墜落、實驗儀器傾倒等。火災：如Oven過熱、電線走火、酒精燈使用不當、化學反應爆炸等。離心機使用不當導致的意外：如離心座未掛好、離心樣品未平衡、離心座腐蝕、低溫跑CsCl等密度離心等。生物性材料污染,實驗室常發生的意外,酸、鹼、腐蝕性、毒性藥品所導致的傷害如SDS、acrylamide、phenol(酚)、CH3HgOH(氫氧化甲基汞)、EtBr等。Phenol蒸餾時，不能以水來冷卻。實驗桌面污染所導致的傷害殘留化學藥物或病原性微生物。切割所導致的傷害紫外光(UVlight)傷害放射性同位素污染,EthidiumBromide(EtBr)的處理,一種突變原(Mutagen)，用於核酸電泳染色Lessthan0.1%ethidiumbromide:placeinlaboratorytrashMorethanorequalto0.1%:placeinbiohazardbagsandtagforpickupandincinerationAqueoussolutionscontaini