血液分子生物学细胞培养技术...ppt

,科研实验技术石小玉教授,显微技术,根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源。电子显微镜以电子束为光源。,、光学显微镜,（一）普通光学显微镜,（二）荧光显微镜细胞中有些物质，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。,荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,（三）激光共聚焦扫描显微境,激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope，ICSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。,激光共聚焦扫描显微镜,LCSM照片蓝色为细胞核绿色为微管,观察细胞形态细胞内生化成分的定量分析光密度统计以及细胞形态的测量,（四）倒置显微镜,组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒。倒置显微镜的物镜在载物台之下。用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,二、电子显微镜,（一）透射电子显微镜,1.基本原理,在光学显微镜下无法看清小于0.2m的细微结构，这些结构称为亚显微结构（submicroscopicstructures）或超微结构（ultramicroscopicstructures；ultrastructures）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。,电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。,2.制样技术,1）超薄切片通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度2050nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差。,2）负染技术负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,肌动蛋白纤维的负染电镜照片,3）冰冻蚀刻冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻。用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,（二）扫描电子显微镜,扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,人类血细胞SEM照片,显微操作/注射仪,显微操作技术（micromanipulationtechnique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作/注射仪（micromanipulator）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，,细胞培养技术Thetechniquesofcellculture,细胞培养的概念摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使细胞在体外生存并维持其结构和功能的方法。选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。,细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,传代（passage）细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期,细胞系（cellline）原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。有限细胞系（finitecellline）细胞系的生存期有限。无限细胞系（infinitecellline）已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性。有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性。,永生性和恶变*永生性：是细胞获得持续生长增殖能力的特性*永生性的细胞不一定具有恶性,但却易演变成恶性细胞,细胞株（cellstrain）通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（substrain）。,克隆（clone）亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,二倍体细胞（diploidcells）染色体数目与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75或80以上）的细胞群。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。二倍体细胞可能长期保持二倍体状态，长期传代后,会发生偏离二倍体现象，有时出现异形染色体。,培养细胞的生长方式1.贴附型必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞；成纤维型细胞；上皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞2.悬浮型于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。,上皮型,成纤维型,悬浮型,成纤维型,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时,贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。,潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。,对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。,培养细胞生存环境、条件和代谢,一、无污染环境*体内:有强大的免疫系统和解毒器官*体外:细胞失去了对微生物和有毒物质的防御能力,二、温度*标准温度:36.50.5*细胞对低温的耐受力比对高温强*39-401小时:细胞受到一定损伤*41-421小时:细胞受到严重损伤*431小时:细胞死亡*1-20:细胞代谢低下,但不损伤细胞*25-35:细胞能生长,但速度减慢*0以下:细胞因胞质结冰而死亡,但加保护剂(二甲基亚砜),冻存于液氮中(-196),能长期保存,三、气体环境和氢离子浓度,主要有氧气和二氧化碳氧气:*封闭式培养,氧分压1995-9975Pa.*开放式培养,95%空气加5%二氧化碳*氧分压超过大气中氧含量,对细胞产生毒害作用,二氧化碳*细胞代谢产物,也是细胞所需成分*主要作用在于能维持培养基的pH值*pH7.2-7.4.*原代培养细胞对pH的变动耐受差*细胞系耐受力强*细胞耐酸性比耐碱大一些,实验准备,实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,超净工作台,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14h)。箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,CO2培养箱,培养板,培养瓶,消化液胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）,血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分,一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加10血清对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56，30分钟。血清的消毒：过滤除菌。,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保