《朱记平开题报告》PPT课件

RAS对禽流感病毒增殖的影响及流感病毒NS1基因eIF4GI结合区缺失株对病毒增殖及细胞因子影响的研究,专业：预防兽医研究生：朱记平导师：金梅林教授,开题报告,RAS蛋白对禽流感病毒在细胞内增殖的影响,一、研究背景二、研究目的三、研究内容四、技术路线五、工作进展,一、研究背景,（一）RAS家族（二）RAS与病毒的潜在关系,（一）RAS家族RAS家族属于常见的癌基因家族种的一类，在正常细胞中以非激活形式存在，故又称为原癌基因。主要特点可概括如下：（1）在进化进程中，基因序列呈高度保守性。（2）它的作用是通过其表达产物蛋白质来体现的；它们的存在对正常细胞不仅无害，而且对维持正常生理功能、调控细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需。（3）在某些因素（如放射线、某些化学物质等）作用下，一旦被激活，发生数量上或结构上的变化时，就会形成癌性的细胞转化基因。,ras家族主要包括Hras,Kras,Nras家族成员基因序列差异大，但所编码的蛋白质是P21，位于细胞质膜内面，P21可与GTP结合，有GTP酶活性，并参与cAMP水平的调节。,Ras蛋白的结晶结构如图所示，当GTP水解时，Ras蛋白的构象会发生改变，此改变涉及L4，它含有第61位点，致癌突变有时在此处发生。Ras的组成型激活的突变发生在L1的第12位点。它直接影响到和GTP的结合。在野生型和癌变型之间的变化限制在这些区域中，并使Ras产生一种构象来承担GTP的水解，这是癌致性的基础，关键是GTP水解能力。,图Ras蛋白的晶体结构含有6个链，4个螺旋和9个连接环。GTP被L9,L7和L1所包被。从30到40的的效应区是相对暴露的，而其他的区域也有暴露的（引自Lewin,2000）,（二）RAS与病毒的潜在关系,1、Activated(oncogenic)rasinducesacellularinhibitorofPKR.(Mundschauandet.）Activatedrasisfoundin30%ofallmalignanthumantumors2、TheactivatedformofPKRiscapableofblockingproteinsynthesisthroughitsabilitytohosphorylatethesubunitofeukaryotictranslationfactor2.Thismechanisminhibitsviralreplication.,AGeneticallyEngineeredInfluenzaAViruswithras-DependentOncolyticPropertiesRas-dependentOncolysiswithanAdenovirusVAIMutantReovirusoncolysis:TheRasRalGEFp38pathwaydictateshostcellpermissivenesstoreovirusinfectionActivatedN-RasContributestotheChemoresistanceofHumanMelanomainSevereCombinedImmunodeficiency(SCifi)MicebyBlockingApoptosis,二、研究目的通过研究NRAS蛋白在细胞内的高表达是否有助于禽流感病毒的增殖，进而分析禽流感病毒与RAS蛋白之间的相互关系，并推断禽流感病毒与细胞癌症转化的相互关系。,三、研究内容,（一）突变N-RAS基因，获得N-RAS高表达细胞系，并进行检测,（二）病毒感染的观察以及病毒输出量测定，PKR活化的测定,（三）研究IFN与RAS的关系,（一）突变N-RAS基因，获得N-RAS高表达细胞系，并进行检测1、根据Genebank登陆的人NRAS序列，设计NRAS基因开放阅读框（570bp）上下游引物，从细胞内扩增NRAS开放阅读框基因，定点突变NRAS12位氨基酸密码子和61位氨基酸密码子，并连接到真核表达载体pCDNA3.1+上（1）突变12位密码子，GGTTGT（2）突变61位密码子，CAAAAA2、脂质体转染法将pCDNA3.1-NRAS质粒转染到VERO细胞内，使用NRAS多克隆抗体，Westernblot分析NRAS蛋白表达情况。,点突变（1）突变12位密码子，GGTTGT5AGCATGTGGTGTTGGGAAAAGC35CACATGCTCCAACCACCACCAGT3（2）突变61位密码子，CAAAAA5GGAAAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGAG35TTCTTTTCCAGCTGTATCCAGTATGTCC3真核表达引物，连在pCDNA3.1+上5GCGGTACCGAAATGACTGAGTACAAACT3(kpnI)5TTGCGGCCGCTTACATCACCACACAT3(NotI),表达质粒构建,KpnI,NotI,NRAS,KpnI,KpnI,NRAS,KpnI,NRAS,KpnI,NRAS,KpnI,（二）病毒感染的观察以及病毒输出量测定，PKR活化的测定,1.以合适MOI病毒量感染293T细胞和VERO细胞。2.免疫荧光分析RAS高表达细胞和正常细胞上病毒感染情况。3.病毒感染RAS高表达和正常细胞，不同时间点收获上清和细胞，空斑试验检测病毒含量。另外用不同剂量病毒感染细胞，相同时间点观察细胞病变。4.感染病毒的RAS高表达细胞，免疫印迹试验检测PKR磷酸化状态（鼠抗总PKR抗体和抗磷酸化PKR抗体）。相同的方法检测ERK的激活状态（抗总ERK1/2抗体和抗磷酸化ERK1/2抗体）,RAS高表达和不表达的VERO细胞，均用IFN-蛋白孵育，然后用病毒感染，观察病毒感染情况。,（三）研究IFN与RAS的关系,Westernblot分析RAS的活化情况,AIV,免疫印迹分析PKRERK磷酸化情况,收获上清检测病毒输出量,免疫荧光分析细胞被感染情况,转染,四、技术路线,pcDNA3.1（+）-Nras,转染,IFN孵育的VERO,293T,VERO细胞,感染,五、工作进展,1、已分别成功突变NRAS基因12位密码子和61位密码子。2、已成功构建pcDNA3.1（+）-Nras表达质粒。,图1细胞中PCR扩增NRAS的结果1DL2000marker2,3PCR产物（约570bp）,图2Pcdna3.1-NRAS酶切鉴定的结果1DL2000marker2DL15000marker3,4Pcdna3.1-NRAS,NS1基因eIF4GI结合区缺失株对病毒增殖及细胞因子影响的研究,研究目的研究背景实验方案实验内容,研究目的,通过对NS1基因eIF4GI结合区不同缺失株生物学特性的比较，分析NS1蛋白中eIF4GI结合位点氨基酸对病毒增殖、复制的影响，以及对细胞因子的抑制作用。,NS基因编码NS1、NS2蛋白。NS1蛋白对流感病毒的复制、转录及装配成病毒粒子这一系列过程都有影响。,研究背景,CPSF,cleavageandpolyadenylationspecificityfactor;eIF4GI,eukaryoticinitiationfactor4GI;NES,nuclearexportsignal;PABII,poly(A)-bindingprotein.,研究背景,研究背景,NS1蛋白可以结合dsRNA，抑制诱导IFN激活酶PKR的活性而成为IFN的拮抗物。近几年研究热点主要是流感病毒NS1基因在病毒复制及逃离宿主免疫反应的重要作用。目前这些研究主要集中在NS1的mRNA结合区。,2000年后分离的病毒中大部分毒株在80-84位出现5个氨基酸的缺失，5个氨基酸的缺失位置正好处于真核转录启动因子（eIF4GI）结合区内（第81-113氨基酸处）。eIF4GI结合区可以调节并优先病毒mRNA的翻译，同时抑制宿主细胞mRNA的翻译，包括干扰素的表达等，但该区域在拮抗IFN等细胞因子产生和逃离宿主免疫反应中的具体作用如何还未有详细报道。,研究背景,研究背景,研究背景,研究背景,NS1基因eIF4GI结合区缺失株,实验方案,delNSvirus,实验方案,6日龄（IFN未产生）,9日龄（IFN开始产生）,11日龄（IFN高含量）,鸡胚,细胞,血凝试验,IFN-,TNF-,IL-6,IL-1,IP-10,细胞因子,细胞凋亡,一病毒增殖趋势的测定,分别在鸡胚和MDCK细胞上做增殖曲线鸡胚上：以0.1EID50的病毒量分别接种6，9，11日龄的鸡胚，用血凝试验检测接种鸡胚24h，48h，72h病毒含量。细胞上：以MOI=0.1，0.01，0.0001的病毒量感染细胞，用血凝试验每天检测感染细胞上清中病毒含量，共检测5天。,实验内容,二细胞因子的测定,以合适MOI的病毒量感染MDCK细胞，四个时间点收集细胞，real-timequantitative-PCR检测感染后细胞IFN-，TNF-，IL-6，IL-1，IP-10细胞因子mRNA水平,实验内容,三细胞凋亡,对于感染病毒的细胞，在不同时间点测定细胞凋亡程度。