霉菌毒素污染现状及危害、霉菌毒素快速检测技术原理及实际应用

霉菌毒素污染及危害现状新型霉菌毒素快速检测技术原理及实际应用,徐超上海澳灵生物科技有限公司2015年9月15日,霉菌污染现状,玉米100%被霉菌污染-程度不同而已混合饲料（预混、浓缩、全价）90%以上被污染常见霉菌毒素：黄曲霉毒素、玉米赤霉酮、赭曲霉毒素、T-2、呕吐毒素、烟曲霉毒素、伏马菌素等毒素污染严重季节：每年3月-10月，连续阴雨受现代整体环境影响，已经不存在无污染地区，即传统认为的北方干燥没有霉菌的概念是非常有害的直接经济损失：2003-2004年度霉菌污染造成饲料畜牧业损失（含家禽）超过150亿元,中国霉菌污染情况,霉菌毒素对饲料、养殖的影响,干扰营养的利用，使饲料转化率降低畜禽生产力降低干扰破坏免疫系统，使免疫力下降，疾病增加，尤其是几种疾病同时感染现象更加严重（如无名高热病、圆环病毒病、细小病毒病等）繁殖障碍，降低繁殖性能因食用畜产品而对人类健康的潜在威胁加重药物使用增加、药物残留现象严重，药效不断下降生产成本升高，效益下降动物死亡,几种疾病的元凶,各种市场质量投诉,动物不采食换料后采食后备母猪、母猪繁殖障碍和其他疾病高温季节的禽类、水产动物等着色不均匀或者不上色的投诉各种肠道类、内脏病变导致的生长不良，饲料转化率降低雏鸡阶段着色很好，青年鸡阶段反而褪色？是不是色素的问题呢？鸡蛋变形，蛋黄易破裂、色彩不自然,惨痛的教训,直接经济损失：2003-2004年度霉菌污染造成饲料畜牧业损失（含家禽）超过150亿元间接损失：母猪繁殖障碍症及其他各种病症相继爆发2009年4-5月份，华东地区饲料企业近1000万元的损失（鸭料中黄曲霉菌严重超标）原因不明导致饲料厂埋单现象（后备母猪繁殖病症、家禽软骨病、乳猪采食下降）,霉菌污染现状及危害,霉菌与霉菌毒素防霉剂的作用霉菌毒素的危害,霉菌的问题,在气候温湿度适宜的情况下，容易出现发霉变质的现象，实际上是不同的霉菌大量繁殖的结果，霉菌是真菌中的一个系列，广泛存在于我们的各种粮食作物、饲料原料以及粮食加工产品和副产品当中，对我们的生活影响很大有益类真菌可以被人类利用为我们的健康提供保障，而有害类真菌则正好相反会严重危害我们的健康霉菌污染中的提到的各类霉菌均是后者,常见产毒素的霉菌,黄曲霉菌呕吐霉菌赤霉霉菌赭曲霉菌烟曲霉菌T-2霉菌,什么是霉菌毒素？,霉菌毒素是由真菌(霉菌)产生的具有毒性的次级代谢产物。主要的产毒素霉菌为曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）和青霉菌属（Penicillium）已知的霉菌毒素有数百种，其分子量在200-500道尔顿，多数没有得到充分研究。霉菌毒素在动物体内可产生多种生理作用:肝毒、肾毒、对中枢神经系统的作用以及类似雌激素效应，等等。,主要的霉菌毒素,黄曲霉毒素(aflatoxin)玉米赤霉烯酮(zearalenone)单端孢霉烯族毒素(trichothecenes)烟曲霉毒素(fumonisin)赫曲毒素A(ochratoxinA)麦角生物碱(ergotalkaloid),黄曲霉毒素T-2毒素赫曲毒素A,黄曲霉毒素的化学结构式,黄曲霉毒素B1,黄曲霉毒素B2,黄曲霉毒素G1,黄曲霉毒素M1,黄曲霉毒素G2,黄曲霉毒素M2,防霉剂的作用,抑制霉菌生长繁殖-不能解除霉菌毒素接触被动型防霉剂：以丙酸钙为主的产品需要有水分的环境才起作用接触主动型防霉剂：以具有挥发性酸盐类为主的产品，如早期的克霉霸产品等产生微量气体，即所谓的气雾熏蒸型产品注意：防霉剂对已经产生的霉菌毒素无作用,霉菌毒素的产生,在谷物收割前或贮存、运输、加工和饲喂过程中,霉菌都可在其中生长并产生霉菌毒素（田间毒素与仓储毒素）。霉菌的生长和霉菌毒素的产生与极端气候造成的植物应激有关,还与虫害、不当的贮存和不良的饲喂条件有关。总之,环境条件,比如热、水和虫害,都会造成植物应激,使植物在农田中易受到霉菌毒素的污染。在收割后,温度、含水量和昆虫活动情况是影响霉菌毒素污染饲料和食品的主要因素(Coulumbe,1993)。,植物应激,霉菌毒素的产生差异,每年霉菌毒素的产生情况和浓度均不相同。每年的气候条件、植物的应激情况均不相同。预测田间玉米黄曲霉毒素浓度的数学模型就是以温度、降水量和虫害为条件的（Dowd,2004)最新研究表明，低温情况下，霉菌已然繁殖迅速，但是是否产生毒素目前还不知,霉菌毒素的毒害作用总体表现,霉菌毒素对动物造成的危害表现,霉菌毒素对饲料养分的破坏,霉菌毒素会改变饲料的营养成分组成；表现为降低动物对养分的利用（下降10%）。研究表明：贮存期间发霉的玉米，其脂肪含量明显减少，由3.8%降低为2.4%，胡萝卜素含量由3.1mg/kg降低为2.3mg/kg，VE含量由此22.1mg/kg降低为20.6mg/kg。（Bartov等，1982）,饲料转化率下降,饲料转化率下降,三黄鸡着色变差,畜禽生产能力降低,黄曲霉毒素体增重腿畸形评分肝脏相对重量ugkg（g100g体重）60602a1.73a5.72a120147b2.21b7.81bKhajarern，1999ab字母不同表示同列均值差异显著（）,黄曲霉毒素对021日龄雏鸭的毒副作用,畜禽生产能力降低,黄曲霉毒素体重瘀伤能量ugkg（g）（微焦耳）05524410.625558365*1.25547314*2.50481*229*5.00385*212*10.00327*206*Tung等，1971*表示与对照组相比差异显著（）,黄曲霉毒素中毒对家禽体重和胴体瘀伤的影响,畜禽生产能力降低,黄曲霉毒素对生长鸡生产性能的影响Jones等，1982,畜禽生产能力降低,T-2毒素对产蛋鸡生产性能的影响T-2毒素（ppm）产蛋率（）蛋重（g）体重（g）0.096.29d52.45b1331.8c0.593.81c51.77ab1312.5b1.091.75b51.35a1286.0a2.086.65a51.33a1284.9aManoj和Devegowda等，2001表示同列差异显著（）,致病机理,赭曲霉毒素引起主要淋巴器官中细胞（淋巴细胞）的退化、减少，显著影响了家禽的细胞免疫水平。由于赭曲霉毒素使免疫系统效应细胞特别是巨噬细胞数量减少，引起循环系统中的免疫球蛋白的数量也减少，导致体液免疫功能也受到次级抑制，,人与动物免疫力缺失与下降,赭曲霉毒素、环匹克尼酸和桔霉素一旦被吸收立即与血浆蛋白结合，这样造成毒素在体内积聚和存留时间延长。T-2毒素中毒引起的免疫抑制主要表现为白细胞数减少和法氏囊退化。随着毒素浓度的增加巨噬细胞的活性也会降低。霉菌毒素潜在的危害非常大，这正是它被称为“隐行杀手”的原因。,霉菌毒素的特点,隐蔽性除了急性霉菌毒素感染，多数情况下属于慢性霉菌毒素污染造成临床症状。同时，由于污染浓度不高，检测有难度。复杂性霉菌毒素具有相互协同作用。受霉菌毒素的自然污染的饲料，其毒性高于人工添加相同浓度霉菌毒素的制成的饲料。发生霉菌毒素中毒的动物并不常常呈现出典型症状，而是消化功能紊乱、采食量降低、健康程度下降、被毛粗乱、饲料效率降低、增重减缓，繁殖性能变差等非特异症状。物种特异性不同霉菌毒素对于不同动物造成的危害不一样。例如，猪对DON非常敏感（1ppm），但是18ppm的DON并不影响来航鸡的增重。蛋鸡对DON的耐受程度更高。,霉菌毒素的协同效应,霉菌毒素的协同效应,几种霉菌毒素协同作用对动物健康和生产性能的副作用比一种霉菌毒素单独作用的副作用要大，即实际生产条件下引起动物生产性能下降和中毒症的单一霉菌毒素的含量低于试验控制条件下引起同样毒性效应的剂量(Swamy，2003)。实际生产条件下动物生产性能下降和某些不可预期的中毒现象，可能是由于不同霉菌毒素间的相互作用造成的。霉菌毒素问的互作可改变中毒的临床症状，导致一系列诊断特征不同于单独作用的症状之和。,霉菌毒素危害的作用机制与外在表现,降低采食量；影响养分消化吸收；影响动物内分泌和外分泌系统；诱发细胞死亡；抑制免疫系统；,霉菌毒素引起的免疫抑制，从而导致条件性病原菌或者病毒引发疾病在临床上越来越常见,霉菌毒素对仔猪免疫系统的危害,随处可见的霉菌毒素,配合饲料和饲料原料中霉菌毒素,配合饲料和饲料原料中霉菌毒素,配合饲料和饲料原料中霉菌毒素,配合饲料和饲料原料中霉菌毒素,配合饲料和饲料原料中霉菌毒素,饲料和饲料原料中的霉菌毒素,2008年饲料以及原料的霉菌毒素,342份样品，包括配合饲料、玉米、玉米加工副产品、小麦、麸皮、蛋白原料（豆粕、鱼粉其他蛋白原料）。仅有20份样品完全没有检测到已知的霉菌毒素。,-张丞等饲料广角2009.5,霉菌毒素调查结果,霉菌毒素调查结论,原料中主要关注玉米和玉米加工副产物（DDG/DDGS、玉米蛋白粉、玉米胚芽粕、酒精糟），这些原料是饲料中霉菌毒素的主要来源。玉米加工副产品霉菌毒素污染程度比玉米本身更严重。各种原料及饲料中霉菌毒素主要为FUMB1、DON及ZON。多种霉菌毒素共存的现象很普遍，80%以上样品中存在两种或者更多的霉菌毒素污染。霉菌毒素导致的动物机体免疫抑制是目前动物疾病频发的首要原因高热病病因(免疫抑制+细菌耐药+猪瘟强毒和高致病性蓝耳病),霉菌毒素对仔猪的危害,仔猪的耐受力低，极易中毒，中毒的仔猪常呈急性发作，出现中枢神经症状，头弯向一侧，头顶猪栏，数天内死亡。,玉米赤霉烯酮对母猪繁殖系统危害,呕吐毒素对猪的危害,赭曲霉毒素对猪的危害,霉菌毒素对家禽的危害,禽类呕吐毒素中毒,霉菌毒素对家禽影响,霉菌毒素对家禽影响,霉菌毒素对家禽影响,霉菌毒素对家禽影响,霉菌毒素危害总结,霉菌毒素对饲料、养殖企业的生产具有重大危害作用霉菌毒素的危害大多数不是因为含量超高导致急性中毒，而是由于长期食用毒素超标的饲料造成体内蓄积引发各种疾病，表现中毒症状一旦出现中毒症状，损失巨大且难以恢复霉菌毒素是肉眼看不见的，需要检测,猪饲料中霉菌毒素的最大允许量,-ByDr.JowamanKhajarernAF=黄曲霉毒素；ZON=玉米赤霉烯酮；T2=T-2毒素；OTA=赭曲霉毒素；FUM=烟曲霉毒素；DON=呕吐毒素,禽饲料中霉菌毒素的最大允许量,-ByDr.JowamanKhajarernAF=黄曲霉毒素；ZON=玉米赤霉烯酮；T2=T-2毒素；OTA=赭曲霉毒素；FUM=烟曲霉毒素；DON=呕吐毒素,奶牛饲料中霉菌毒素的最大允许量,-ByDr.JowamanKhajarernAF=黄曲霉毒素；ZON=玉米赤霉烯酮；T2=T-2毒素；OTA=赭曲霉毒素；FUM=烟曲霉毒素；DON=呕吐毒素,霉菌毒素检测技术,注意区别：霉菌检测方法（意义不大）全定量分析（液相色谱、试剂盒、酶标仪等设备）实验室快速检测方法-酶联免疫吸附法（ELISA试剂盒)现场快速检测法-利用抗体抗原的特异性反应，在20分钟内判断霉菌毒素污染程度在饲料生产前就可以提供直接霉菌污染处理依据,快速检测方法的现实意义,真实性，让我们真实的感受到霉菌的存在经济性，较低的成本直观判断霉菌的存在快速性，较短的时间可以看到霉菌的存在时效性，大大缩短事先预防、事后监控所需时间，提高品控效率实用性，操作简单，易学，实用性很强降低企业经营中的霉菌污染风险为企业解决霉菌提供最为直接的依据便利性：可在现场开展检测工作,快速检测方法的优势,定性：可以明确知道有哪些种类毒素定量：可以在检测灵敏度范围内量化快速：从样品称量到结果20分钟内结束简便：不需要专业仪器和专业人员成本低：几十元全部搞定，单独检测事前预防：在确定了霉菌种类和污染程度后，采取预防措施防范风险及时性和现场性：现场品控技术所必需,应用及现实意义,1、确定原料中霉菌种类和浓度范围2、确定成品料霉菌种类和浓度范围3、确定霉菌毒素吸附剂使用种类和量以及其他添加剂（如色素)的使用量4、精确添加成本，保证去毒效果5、客户投诉后的自我快速检查6、检测单位的快速筛查7、合理调整质量保质期（夏秋与冬春）,不同地区企业的应用指导,西部地区和北方大部分地区黄曲霉不是主要霉菌污染源，玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素是主要的长江流域以南地区基本上都有4种以上霉菌交叉污染，其中黄曲霉是首位，最新情况表明，毒害严重的也不是黄曲霉毒素解决饲料厂客户霉菌毒素污染困惑问题，提高服务满意度,不同黄曲霉毒素浓度处理方法,1、先检测主要原料中霉菌污染情况玉米、DDGS、花生粕、豆粕、小麦、棉粕其他原料2、用原料检测数据上限值，根据配方情况计算饲料成品中霉菌毒素的污染程度，再扩大1.5倍为最后数值3、按照对应表格中参考数据采取措施，科学合理的使用霉菌吸附剂,不同黄曲霉毒素浓度处理方法举例,饲料企业霉菌解决方案成本控制,科学界定污染程度，合理使用吸附剂产品，降低使用成本成品检测含量主要用于市场出现问题后的留样快速检测核定以及养殖场的饲料进场检测、或者对于需要承诺霉菌污染指标的客户转嫁成本：将检测成本适当转嫁给原料供应商，在原料指标中增加霉菌污染指标，在超标原料使用脱毒技术时的成本分担,检测技术应用方法,技术部制定原料霉菌毒素污染内控标准，并进行备案明确告知原料供应商品控部执行企业内控标准，并按照此标准进行检测根据检测结果，低于标准合格的原料可以直接使用，超标的阳性原料视原料可替代情况酌情进行更高限量的检测对于容易被污染的原料存放时间达到7天以上的，在使用前必须进行再次检测,霉菌毒素快速检测技术原理-霉菌毒素检测技术的革命,霉菌毒素检测方法,饲料中霉菌及霉菌毒素的传统检测方法主要有目测法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、放射免疫法(KIA)及气相色谱法等。实验室快速检测法-ELISA试剂盒法现场快速检测法-金标试纸卡法，2009年6月份开始推广,薄层层析法(TLC),TLC法是我国测定食品及饲料中霉菌毒素的国家标准方法之一,其原理是针对不同的样品,用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来,经柱层析净化,再在薄层板上层析展开、分离,利用霉菌毒素的荧光性,根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。TLC法由于设备简单,易于普及,所以国内外仍在使用,但该法样品前处理繁琐,且提取和净化效果不够理想,提取液中杂质较多,在展开时影响斑点的荧光强度,而双向展开虽避免了杂质干扰，但增加了操作步骤和时间(叶雪珠,2003)。,液相色谱法(HPLC),HPLC法是近几年发展起来的检测霉菌毒素的方法,主要是用荧光检测器检测,在适宜的流动相条件下,采用反相C18柱,使霉菌毒素同时分离。用HPLC法检测,最低检出量0.08ng,回收率为92.87%。该法快速而准确,但需要昂贵的仪器设备。并且需要几十个甚至更多的样品集中同时处理后检测，否则代价昂贵，除科研法定机构外生产企业承担不起也没有必要承担这个费用,酶联免疫法(ELISA),ELISA-试剂盒法（实验室快速检测法）是1971年提出的。基本原理：在合适的载体上,酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原抗体复合物,在酶底物参与下,复合物上的酶催化底物使其水解,氧化或还原成为另一种带色物质。可用分光光度计进行测定,从而可计算出参与反应的抗原和抗体的含量(杨利国,1998)。该免疫学方法更实际,其灵敏度与TLC或HPLC法相当或更高,因而具有更广阔的应用前景。,酶联免疫法(ELISA),该法由于快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备,且对样品纯度要求不高等特性,特别适用于大批量样品的集中检测。对操作环境有较高要求，对操作人员的熟练程度要求也高，不能在现场开展检测样品少时会造成太大浪费，增加检测成本，不适用于单一饲料养殖企业的快速检测样品前处理需要的时间较长，整体检测需要时间也较长试剂保存条件有特殊要求，需配备酶标仪,快速试纸条检测原理-可用于现场检测的技术霉菌毒素检测技术的革命,检测原理1（以黄曲霉毒素为例）,试纸含有被事先包被于层析膜上检测线（T线）位置的AFB1-BSA竞争抗原和标记在纳米胶体金颗粒上的AFB1特异性抗体。,AFB1胶体金特异性抗体,AFB1-BSA竞争抗原T线,检测液滴孔S,二抗捕获线质量控制线C线,快速检测原理1,测试时，样品检测液滴入试纸条加液孔内，如AFB1在检测液中浓度低于5ng/ml时，胶体金抗体不能与AFB1全部结合。这样，胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的AFB1-BSA偶联物结合，在检测线（T线）内会出现一条紫红色条带，是为阴性，说明被检样品毒素含量不超检测限值。如果AFB1在样品检测液中浓度高于5ng/ml时，胶体金抗体与AFB1全部结合，从而在检测线（T线）内因为竞争反应不会与AFB1-BSA偶联物结合而不出现紫红色条带，是为阳性，说明被检样品中毒素含量超出了检测限值。,检测试剂组成示意图,固定相,检测试剂原理示意图2采用胶体金免疫层析技术，应用免疫竞争反应,样品中被检毒素含量低于检测限值情况-阴性,检测试剂原理示意图2,样品中毒素含量高于检测限值情况-阳性,检测试剂原理示意图2,样品中没有被检毒素含量情况-阴性,样本要求,根据规定采取有代表性试样。对局部发霉变质的试样检验时，应单独取样。每份分析测定用的试样应从大样经连续多次用四分法缩减至0.5kg1kg，然后全部粉碎；萃取用的试样经连续多次用四分法缩减至5g-10g。尤其是对于少量多批次原料混合使用时，采样后的四分法取样非常重要,样本处理简图,萃取定容过程,2g过20目筛（实验室小型粉碎机即可）粉碎样品，加水2ml（纯净水或蒸馏水），加入乙酸乙酯（分析纯）8ml，振荡萃取5min，静置或4000r离心1min后，取上清液2ml吹干（烘干），杯底杯壁残留物即为含有被萃取出毒素的检测物混合体。,乙酸乙酯提取吹干复溶法不同测定限量复溶所用稀释液量的对照表,检测卡使用方法,1、从包装袋中取出试纸卡，打开后平放在桌面上，做好标记，并在1小时内尽快地使用（受潮后试剂失效）。2、加样：用吸管吸取稀释后的待测溶液，缓慢滴加3-5滴待测液到试卡加样S处小孔中，同时计时。3、判断结果：5min内判读结果,操作图示,结果判断图示,检测时间短，从样品