真核基因表达系统ppt课件

.第8章真核表达系统chapter 8 eukaryoticexpressionsystem，概述真核基因结构和表达调控特性真核表达系统(eukaryoticgeneexpressionsystems)，第1部分概述，1，真核基因组的复杂性2，原核表达系统的局限性3，真核表达系统的必要性和优点。1，真核基因组的复杂性，1。真核基因组巨大的大肠杆菌基因组约为4106bp，哺乳动物基因组约为109bp数量级大肠杆菌有4000个基因，人约有10万个基因。2.真核生物遗传信息复杂原核生物的基因组基本上是反水体，真核基因组构成了二倍体真核生物的主要遗传物质和组蛋白等染色质，包裹在核膜内，核内有线粒体DNA等遗传成分，增加了基因表达调控的水平和复杂性。细菌大部分基因按功能相关的顺序排列，形成操作者，一起打开或关闭，多顺子的mRNA战死。真核生物是由一个结构基因转录一个mRNA而产生的。也就是说，mRNA基本上是没有操作者结构的简单半角(monocistron)。真核细胞中的许多活性蛋白质是由相同的、不同的多肽形成的子键组成的，这涉及到真核基因调控表达问题，这个问题比原核生物复杂得多。3 .真核生物基因调控表达，4 .真核生物基因编码复杂，原核生物基因组中的大部分序列是基因编码，核酸杂交等实验是哺乳动物基因组中约10%的序列是蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余90%的序列功能至今还不清楚。原核生物中的基因编码为蛋白质的序列绝大多数是连续的，而真核生物编码为蛋白质的基因绝大多数不是连续的。因为有exon和intron，转录后要通过剥离去除整合物才能翻译出完美的蛋白质，所以基因表达调控环增加了。原核基因组中除了有rRNA、tRNA基因的多个副本外，几乎没有重复。哺乳动物基因组中有很多重复序列。真核生物mRNA5有盖结构，3”端有波利亚尾巴。1，无转录后剪接和加工系统2，翻译后加工修饰系统不足：糖化，磷酸化，甲基化不能修改。影响特定蛋白质的活性。第二，原核表达系统的局限性，3、原核细胞表达真核蛋白的不稳定性容易被细菌蛋白酶分解；很难实现真正的细胞分泌，产量很低。信号肽切割得好，或在特定位置不切。表达产物经常以包涵体的形式存在，后期变性，复性效率低下4，内毒素污染(contaminationofendotoxin)，1。转录处理系统：2。翻译后修改系统3。启用真正的分泌表达，第三，真核表达系统的必要性和优点。(a)真核基因表达调控特性-多层次、多方面(2)真核基因表达调控模型，第二节真核基因表达调控特性featuresofeukarayoticgenestructureandexpression。真核基因表达的调控模式(theregulatingmodelofkaryoticgeneexpression)，1，转录前级(基因组级):genelevel2，转录级调控：transcriptionlevel3，1，转录前水平(基因组水平):genelevel基因结构的变化，稳定，持久，不可逆转，组蛋白修饰，DNA甲基化等。2 .转录水平调节顺式调节因子(cis-actingelement)转发器(trans-actingfactor)，(1)与cis-actingelement结构基因周围的特定转录因子结合，可以启动转录的DNA序列主要是定型调节作用：启动子，增强者负调节作用：沉默，终止者，尾部信号，启动子位于与基因5 的结束和转录开始相关的核苷酸序列中。其特点是近距离作用、方向性、空间位置更加固定。通常包括核心启动子元素：RNA聚合酶早期转录所需的最小DNA序列，基因转录的确切起始位置生成基本级转录，转录起点和-30区TATA-box上行启动子元素(upstreampromoterelements，哺乳动物RNA聚合酶启动子中常见的组成部分。增强器必须起到提高转录效率的净调节元件增强器的作用，但增强器对启动子有严格的特异性无向性(序列，位置)远场作用(1-4kB)无基因特异性，组织特定，构建向量，沉默者或阻尼者是由充当转录终止信号(如增长者)的基因转录终止信号，以及由波亚上游10-20bp的尾部信号(polyAt polyA)和波亚下游的G/T集群组成的反作用力因子，转录信号1，p，trans-acting factor，trans-acting factor (DNA结合蛋白)，cis-acting factor，3、转录后变形的内含子剪接mRNA的尾部和帽子mRNA的稳定性。4，翻译级别的调节主要是microRNA对mRNA、tRNA和rRNA的调节，5，翻译后切除信号肽糖基化乙酰化磷酸化甲基化蛋白的降解，第三节真核表达系统，组成：真核表达载体受体细胞，适合真核表达载体，真核细胞表达外源基因的载体。真核向量可根据受体分为多种。酵母表达载体哺乳动物细胞表达载体昆虫杆状病毒表达载体，根据受体细胞，受体细胞及表达载体，可分为三种。酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统，简单发酵，快速低成本真核生物，翻译后受精功能分泌表达，纯化工艺受体细胞安全，第一，酵母表达系统。(a)酵母载体：1，概念：外源基因在酵母细胞中复制、扩增、表达的载体(包括克隆和表达载体)。2，成分：基因标记调控序列，1)基因标记：重组体的筛选和营养标记基因鉴定：亮氨酸(Leu)抗生素选择标记基因：肌苷，2)调节序列ARS:酵母克隆起始区域(点)酵母启动子：常用甘油激酶(: pgk)GAP(3-磷酸甘油脱氢酶)ADH1(酒精脱氢酶)SUC(蔗糖酶)，3，types酵母复制载体：YIP，YRP，YEP酵母表达载体：酵母复制载体酵母启动子，(1)酵母克隆载体的构建，酵母整合质粒。Yip)细菌质粒DNA酵母基因标记，通过同源重组整合到酵母染色体中，转基因者稳定，但转化率很低。酵母克隆质粒(Yeastreplicableplasmid，YRp)细菌质粒DNA酵母基因标记(YIp)酵母克隆序列(ARS)，可以自主克隆，但稳定性差异酵母附加子类型质粒，YEp:细菌质粒DNA酵母标记基因，酵母克隆序列，酵母2M质粒，(2)酵母表达载体，特征：酵母启动子穿梭载体：在原核细胞中复制外源基因，在真核细胞中表达的载体。种类：啤酒酵母表达载体毕赤酵母表达载体：分泌表达载体非分泌表达载体，啤酒酵母表达载体，-集成，(3)酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，ya c-DNA的大片段，由以下成分组成的酵母染色体2umDNA的克隆开始(CEN)沙漠虫端粒DNA(TEL)，ya c :使用酵母的CENtre段(CEN)、自动复制序列(ARS)和tetrahymena端粒DNA(TEL)制造的人工染色体结构：左臂：TEL，选择标记，ARS，cel，2)受体细胞1。啤酒酵母：早使用，安全性高，经FDA确认，安全生物表达量低的过量糖化转化者不稳定，容易发生质粒丢失。2 .Pichia pastoris:新开发的酵母受体细胞高表达(12g/L)稳定性高-载体集成高分泌(10g/L)，3)转换，1。原生质体方法：移除厚壁2。电穿孔法：高效，整合向量转换前酶线性化3。LiCl方法：使其成为易感细胞，4)外源基因在酵母中的表达，1，细胞内的表达：HBsAg的酵母重组疫苗2，分泌表达，5)高表达策略(1)使用诱导的强启动子：在毕赤酵母表达载体中，通常具有较好激活能力的GAP启动子(2)整合拷贝数提高：利用载体中提供的抗生素遗传标记，可以对包含多份拷贝的转基因体进行抗生素加压筛选。(3)控制蛋白酶解活性：利用蛋白酶缺乏宿主细菌改变发酵培养基的PH值，或将氨基酸或多肽添加到培养基中，可以防止产物分解。(4)分泌表达：这也是避免产品分解的好策略。酵母双杂交系统，YeastTwo-HybridSystem，酵母双杂交系统在真核模型生物酵母中进行，研究活细胞内蛋白质相互作用，蛋白质间的微弱瞬时作用也通过对报告基因的表达产物敏感而检测出来。1989年，美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。蛋白质的酵母双杂交实验是研究基于酵母遗传分析的反作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控的影响的实验。很久以前就知道转录激活蛋白与DNA上的特定序列结合，开始该基因的转录反应。这种DNA结合和转录激活功能分别由转录激活蛋白中的两个不同域-DNA结合域(BD)和转录激活域(ActivationDomain，AD)完成，这两个域都需要基因的转录激活，这两个域各自对彼此没有影响。单独存在时没有转录激活功能，只有通过共享结合或非共享结合形成的空间结构才能显示出完全激活特定基因表达的激活因子的功能。基本原理是，在使用GAL4系统筛选cDNA库或研究蛋白质之间的相互作用时，将DNA结合域和目标蛋白(即“诱饵”)结合在一起，将转录激活域和库蛋白或要验证的蛋白质结合在一起。通常，单个BD可以与GAL4上游激活序列(GALUAS)组合，但不会导致战士，并且单独的AD不能与GALUAS组合。只有当BD和AD分别表达的融合蛋白由于相互作用在空间上相互靠近时，BD和AD才能与GALUAS结合，导致报告基因的转录。已知蛋白质x和BD-fusion -诱饵未知蛋白质y和AD-fusion -食物或目标蛋白报告基因-ll，lac zrter-blue/whites creen inghis 3 reporter-screen ohis media(usualceed to add 3 attointerseselectivity)leu 2 rer已知蛋白质的cDNA序列以bait(贝特)融合DNA结合域(BD)构建为诱饵质粒，将正在筛选的蛋白质的cDNA序列和转录激活域(AD)融合成库质粒，将这两个质粒同时转换成酵母细胞，从酵母细胞分离的DNA结合域和转录激活域相互作用，酵母双杂交系统的优点，灵敏度高。真实性。检查在活细胞内进行，作用条件和作用力在一定程度上表示细胞内的实际情况，无需模拟。简单。融合蛋白相互作用，减少了制造抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。普遍性。CDNA库可以使用属于不同组织和器官的细胞类型和分化期的物质，分析细胞质、细胞核和膜蛋