1 第一章 基因工程概论.ppt

,GeneticEngineering,基因工程,ChapterI,本门课的教学方法和形式,一、教学目的与要求,学时/学分：46/3上课方式：讲解为主考试时间：待定最终成绩平时成绩期中期末,Telmail：minli,附1：推荐用参考书,何水林，基因工程(第一版)，科学出版社，2008张惠展基因工程（第二版），高教出版社，2009吴乃虎，基因工程原理（第二版），科学出版社楼士林，基因工程，科学出版社分子克隆实验指南（第三版）,目录,基因工程概论,1,基因工程的工具酶,2,基因工程载体,3,基因工程的主要技术及原理,4,目的基因的克隆与分离,5,基因的转移与重组体的筛选和鉴定,6,克隆基因的表达,7,在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。,基因工程要素：包括外源DNA；载体分子工具酶和受体细胞等。,基因工程的定义,第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的安全性第四节基因工程的应用第五节基因工程的商业化发展,一、基因工程诞生的理论基础,二、基因工程诞生的技术突破,三、基因工程的基本原理,四、基因工程的支撑技术,五、基因工程的诞生,六、基因工程的特征,第一节基因工程的诞生,。,1944年，AveryO.T.利用肺炎双球菌转化实验证明了DNA是遗传物质,一、基因工程诞生的理论基础,第一节基因工程的诞生,1.DNA是遗传物质,1944年，美国洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。（1）S型菌细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase处理的S型菌细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌细胞提取物仍有转化作用。不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。,第一节基因工程的诞生,一、基因工程诞生的理论基础,1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。解决了基因的自我复制和传递问题,Watson和Crick,2.DNA双螺旋结构,一、基因工程诞生的理论基础,第一节基因工程的诞生,既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。,3.中心法则和遗传密码,第一节基因工程的诞生,a.遗传密码是通用的,b.基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,说明基因组是可以重组的,三联密码子同氨基酸间的对应关系，在所有生物中都是相同的：重组分子导入生物中只要具备转录和翻译的条件合成出原样的氨基酸,经重组的基因一般是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物,4.基因是可以切割和转移的,第一节基因工程的诞生,1970年H.O.Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，Boyer等相继发现了coRI一类重要的限制性内切酶。,WernerArber1968年发现限制酶,1.工具酶的发现与应用,二、基因工程诞生的技术突破,第一节基因工程的诞生,第一节基因工程的诞生,1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。,1.工具酶的发现与应用,第一节基因工程的诞生,第一节基因工程的诞生,1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使真核基因的制备成为了可能。,2.反转录酶的发现与应用,第一节基因工程的诞生,1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。,3.载体的发现与应用,第一节基因工程的诞生,1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。,3.载体的发现与应用,第一节基因工程的诞生,1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。,4.感受态体系,第一节基因工程的诞生,1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。,1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术。,1980年Nobel化学奖,5.琼脂糖凝胶电泳,6.DNA测序技术,第一节基因工程的诞生,核酸凝胶电泳技术,核酸分子杂交技术,细菌转化转染技术,DNA序列分析技术,寡核苷酸合成技术,基因定点突变技术,聚合酶链反应（PCR）技术,三、基因工程的支撑技术,第一节基因工程的诞生,1980年Nobel化学奖,1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：,用EcoI内切酶消化猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体的DNA，再用T4DNA连接酶将其连接起来。,1.Berg的开创性实验,四、基因工程的诞生,第一节基因工程的诞生,1973年斯坦福大学S.Cohen小组将含有新霉素抗性基因的大肠杆菌R6-3质粒与含有四环素抗性基因的质粒pSC101连接成重组质粒，转化获得具有双重抗药性的大肠杆菌。,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。,2.Boyer-Cohen实验,第一节基因工程的诞生,Boyer-Cohen实验,第一节基因工程的诞生,将一外源基因转到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。,外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和表达。,1.跨物种性,2.无性扩增,五、基因工程的特征,第一节基因工程的诞生,第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的安全性第四节基因工程的应用第五节基因工程的商业化发展,从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。,将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。,第二节基因工程的研究内容,1.目的基因的获取,2.重组体的制备,切,接,将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。,对转入重组子的受体细胞进行培养,以扩增DNA重组子或使其整合到受体细胞的基因组中。,第二节基因工程的研究内容,3.重组体的转化,4.重组子的培养,增,转,使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。,基因工程的操作过程可简化为:,挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。,5.克隆的鉴定,第二节基因工程的研究内容,6.目的基因的表达,检,生物材料,RNA,mRNA,DNA,cDNA文库,基因组文库,人工合成,目的基因,克隆载体,受体细胞,重组,克隆子,转基因生物,第二节基因工程的研究内容,基因研究的技术路线,第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的安全性第四节基因工程的应用第五节基因工程的商业化发展,制造带有抗生素抗性基因的新型微生物，有可能在人类或其它生物体内传播。,重新组合一种在自然界尚未发现的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。,第三节基因工程的安全性,一、基因工程的安全隐患,1.对环境的影响,2.新型病毒的出现,将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。,新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。,3.癌症扩散,4.人造生物扩散,第三节基因工程的安全性,1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,第三节基因工程的安全性,二、重组DNA研究的安全准则,1.公众的担忧,1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请PaulBerg博士组成一个重组DNA咨询委员会。,这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。,2.专家的态度,第三节基因工程的安全性,1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。,规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。,第三节基因工程的安全性,3.制定安全准则,分4级：P1P4级。,（1）实验室的物理安全,一般装备良好的普通微生物实验室。,P1级实验室,P2级实验室,在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。,第三节基因工程的安全性,4.基因工程的安全措施,负压柜:气流经操作人员向内进入工作台面，被污染的气流通过HEPA过滤器外排出柜外，没有循环气流。保护操作人员和环境不受污染。,第三节基因工程的安全性,全负压的实验室，同时装备安全操作柜。,P4级实验室,专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。具有最高安全防护措施。,P3级实验室,第三节基因工程的安全性,在自然环境中无法存活。,（2）实验室的生物安全,分3级（大肠杆菌）：EK1EK3级。,EK1级的大肠杆菌,在自然环境中一般都要死亡。,EK2-EK3级大肠杆菌,第一个“安全”菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。,第三节基因工程的安全性,（3）载体的安全,应该是失去了自我迁移的能力。,不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。如pMB9，pBR322等。,第三节基因工程的安全性,第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的安全性第四节基因工程的应用第五节基因工程的商业化发展,基因分离酶切,载体酶切,基因和载体连接,导入细菌,重组质粒繁殖,重组克隆的选择,序列分析和基因表达等研究,基因工程的基本流程,改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（1）提高CO2的固定率,改变光能交换系统的分子的基因结构。,（2）提高光能吸收率和转化率,第四节基因工程的应用,一、基因工程在农业生产中的应用,1.提高植物的光合作用效率,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。,是农业生物技术的主要内容。将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。,2.提高豆科植物的固氮效率,3.转基因植物,第四节基因工程的应用,抗癌抗衰老的紫色西红柿,补钙的胡萝卜,满地尽是黄金米,帮孩子保护眼睛,抗冻的草莓会有鱼腥味么？,带有胰岛素基因的生菜,当苹果爱上葡萄的时候,散发柠檬香味的西红柿,富含多种维生素,玉米中的超级精英,一切只是幻想？一切皆有可能！,第四节基因工程的应用,世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）,第四节基因工程的应用,中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）,中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）续表1,第四节基因工程的应用,中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）续表2,第四节基因工程的应用,将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),4.转基因动物,第四节基因工程的应用,转基因荧光猪,转基因猴安迪,(ANDi),2004年，美国科学家研制出世界上第一只转基因蝴蝶。,转基因鱼,转基因鱼,转基因蚕,第四节基因工程的应用,利用转基因猪器官进行猪灵长类异种移植,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,第四节基因工程的应用,二、基因工程在工业中的应用,1.纤维素的开发利用,2.酿酒工业,1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,第四节基因工程的应用,三、基因工程在医药上的应用,Genentech的骄人业绩,第四节基因工程的应用,制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）,大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等,应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂,1.用转基因植物或动物生产药物,2.用微生物生产药物,3.设计高效特异的生物制剂,4.研制疫苗,第四节基因工程的应用,第四节基因工程的应用,基因工程药物,第四节基因工程的应用,基因工程药物（续表）,中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）,第四节基因工程的应用,中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）续表1,第四节基因工程的应用,中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）续表2,第四节基因工程的应用,将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。,（仍在探索阶段）,5.基因诊断,6.法医鉴定,7.基因治疗,第四节基因工程的应用,基因治疗GeneTherapy,1990年，美国医学家安德森对一例患腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。该女孩由于先天缺乏ADA基因，先天免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受特定抗体的治疗。,美国医学家安德森,谢德尔，1999,经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。,用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。,用重组细菌或转基因鱼等检测水污染,第四节基因工程的应用,四、基因工程在环境保护中的应用,1.检测水污染,2.生物降解,第一节基因工程的诞生第二节基因工程的研究内容第三节基因工程的安全性第四节基因工程的应用第五节基因工程的商业化发展,生物技术的发展在某种程度上是由商品经济的发展所推动的。,Genentech公司1980年上市后20分钟内由35$涨到89$/股。,1980-1983年，美国成立了200多家生物技术公司。1985年400多家，目前1300多家。现在几乎每个大跨国公