绿色荧光蛋白分子实验

.,绿色荧光蛋白报告基因的克隆,.,基本原理：多聚酶链式反应是DNA的体外酶促扩增。是利用两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，使目的DNA片段在一定时间以指数方式增加百万倍。,1.PCR扩增获得目的基因,.,1、dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。2、模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。3、Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。4、退火温度对PCR的特异性有较大影响。5、变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。6、循环数过多易产生非特异扩增。,影响因素：,.,7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。8、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。9、变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。10、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性；二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。,.,实验结果,pcr扩增获得目的基因的凝胶电泳图,PCR产物,引物,模板跑胶条带几乎看不到。,.,基本原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。注意事项及影响因素：1.对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.52%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。,2、凝胶电泳回收目的基因,.,2、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。3、注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。4、注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。5、正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。,.,实验结果,条带清晰。,PCR产物回收的检验电泳图。,.,原理：在Mg2和ATP存在下，T4DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。影响DNA连接反应的因素：1、连接缓冲液的影响：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。2、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统上将连接温度定为16，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得较好的连接效果。,3、目的基因与载体的连接,.,3、酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。4、DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物，DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。,.,实验原理：转化(Transformation)是将异源DNA分子引入另一原核细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。感受态细胞：在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，称感受态细胞。,4、连接产物转化大肠杆菌,.,试验方法热休克法,10L载体DNA,Onice混合，静置10min,40L感受态菌,42C45秒,37摇1h,加入1mLLB培养基,200L转化液+16ulIPTG+40ulX-Gal，涂含抗菌素的平板,.,检验是否从大肠杆菌中提取出质粒DNA的电泳图。,.,细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储存于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,影响转化率的因素,.,蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖乳糖类似物异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的乳糖苷酶X-gal蓝色吲哚产物,重组子的筛选技术蓝白斑筛选法,.,实验原理：-半乳糖苷酶是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，最常用的-半乳糖苷酶基因来自大肠杆菌lac操纵子，它们使载体中带有大肠杆菌lac操纵子的调节序列和编码-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列。用异丙基-D-半乳糖苷(IPTG)可诱导这个末端片段的合成，合成的片段能与宿主编码的-半乳糖苷酶缺陷型进行互补，恢复该酶的活性，这一过程称为-互补。由于克隆用载体pGEM-TEasyVector带有lacZ的调节序列和-半乳糖苷酶的部分编码序列，可以与缺陷型宿主DH5在诱导物IPTG存在下，形成-互补，宿主菌在含色素底物X-gal的培养基平板上形成蓝斑；在有外源DNA片段插入到载体多克隆位点时，就使载体编码-半乳糖苷酶的部分序列失活，带有重组质粒的宿主菌产生白斑。为提高筛选的准确性，实验中采取蓝白斑筛选法。,.,.,.,.,实验原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。,6、碱裂解法提取质粒DNA,.,注意事项：提取过程应尽量保持低温。沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。,.,实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。在细菌的细胞内，质粒主要以超螺旋形式（ccDNA）存在。在提取质粒的过程中，还有另外两种存在形式：线性（linearDNA）和松弛型(ocDNA)。超螺旋DNA线形DNA松弛螺旋状DNA,7、质粒酶切鉴定及电泳检测,.,限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA片段。如：EcoR和Hind的识别序列和切口是：EcoR：GAATTCHind：AAGCTT,.,限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。,.,酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水注意：不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer。1，DNA：重组质粒，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，以免影响酶的活性。2，酶：酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。(因为酶是储存在50%甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5%就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置)。3，buffer：不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种buffer，有些buffer中需要另外添加BSA。,.,4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上。6，双酶切因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况：1)两种酶是同样的buffer。尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种