蛋白质、多肽类药物质量控制课件

蛋白质，多肽药物质量控制，2018.4.13，蛋白质，多肽药物，由50多个氨基酸组成的肽称为蛋白质，因此蛋白质和多肽没有太大区别。优点：生物活性高，特异性强，毒性低。缺点：稳定性差，容易停用，大分子，多成分。奥曲肽，广纳他林醋酸，太难了，蛋白质，多肽药物质量控制，1。识别2 .检查3 .含量测定，1 .识别，1.1化学反应1.2高效液相色谱(保留时间)1.3红外光谱(脱氨加压素)1.4紫外光谱1.5肽图分析(重组肽)1.6核磁共振(催产素，高丝氨酸)1.7毛细管电泳(重组肽)1.8液相色谱液相C18或C8热，0.1%三氟乙酸数和0.1%三氟乙酸的乙腈梯度浸出，波长214纳米检测。第二溴化氰裂解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，试验图和比较基准图。事实基本上不能相同，肽图分析存在的问题，系统适合性在哪里？实验中复杂的预处理过程是如何再现的？粗糙的规则如何统一判定尺度？向抗生素和中药学习，提供特性峰、标准图，消除溶剂峰，引入相似性评价，推荐柱，积分条件，空溶液配制方法等。2 .检查，2.1氨基酸分析2.2分子量和分子量分布2.3相关物质2.4 pyrogen 2.5残留溶剂，2.1氨基酸分析，2.1.1酸水解6mol/L盐酸，110，真空，20-24小时。优点：氨基酸不旋转。缺点：色氨酸完全破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺完全水解，半胱氨酸无法直接测定。2.1氨基酸分析，2.1.2碱水解5毫升/L氢氧化钠溶液，氮气充填管，110，22小时。优点：色氨酸稳定性。缺点：氨基酸消旋，大部分氨基酸被破坏。2.1氨基酸分析，2.1.3酶水解蛋白酶组的优点：条件温和，氨基酸不被挤压，不被破坏。缺点：水解不完整。2.1氨基酸分析，2.1.4柱后衍生化柱分离后与衍生化试剂(茚三酮，荧光胺)反应。优点：易于量化和自动化任务。缺点：灵敏度低，需要额外的设备，峰值扩展，分辨率低。2.1氨基酸分析，2.1.5柱前诱导性氨基酸在化学偶联试剂(酞菁、苯甲酰等)之前反应，然后分离检测。优点：灵敏度高，分辨率高，可以用一般HPLC分析。缺点：部分衍生物的不稳定性，副产品干扰分离和检测。museuv 氨基酸相关物质的研究，目前中国药典 2015年版氨基酸制剂杂质控制测定“其他氨基酸”，用TLC方法喷射茚三酮试验液的发色。如何控制其他杂质？困难：种类多，分子量小，弱紫外线吸收，良性电解质，溶解度差异大。杂质来源：不稳定氨基酸，高温杀菌，生产工艺差距。2.2分子量和分子量分布，2.2.1分子排斥色谱，2.2分子量和分子量分布，2.2.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，2.2分子量和分子量分布，2.2.3ESI-MS，2.2分子量和分子量分布，2 . 2 . 4 maldi 3354 too2.3.2毛细管电泳消耗少，分离模式多，操作方便。2.3.3液相色谱-质量特异性，灵敏度很高。2.3.4高效分子排斥色谱用于高分子量蛋白质物质检测。2.4热源，2.4.1兔子方法兔子不稳定2.4.2试剂是革兰氏阴性细菌的酯多糖2.4.3人全血细胞新鲜健康人的全血是？实验者直接泵送。2.4.4人单核细胞株对于不同的热源-内毒素、脂质酸、酵母多糖等，更适合于基质多种生物分子的热源检查。2.5残留溶剂，气相顶空注入最好不要使用液体注入、针头切断、入口切断。不行的话气质会融合在一起。3 .含量测定，3.1 kjeldahl法3.2 forest苯酚法3.3 bisurea法3.4BCA法3.5 comas亮蓝法3.6紫外分光光度法3.7荧光光度法，3.8蛋白印迹法3.9高效液相色谱3.10毛细管电泳3.11电位滴定3.13氨基酸比，3.1 kjeldahl法然后在碱性条件下蒸馏，将铵盐转换为氨，与水蒸气一起蒸馏，吸收到过量的硼酸盐，然后用硫酸或盐酸标准溶液滴定，计算样品中的氮量。蛋白质含量相对恒定，因此可以用蛋白质含量=氮含量/16%来计算蛋白质含量。3.1 kjeldahl法，3.2福林酚法，原则：碱性条件下蛋白质与铜相结合形成复合物，蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基在福林试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐中，将6价钨还原为深蓝色混合物。650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比。3.2福林酚法，3.3双尿素法，原理：在强碱性溶液中，蛋白质肽键形成Cu2和紫色复合物，与蛋白质浓度和蛋白质含量成正比，与蛋白质分子量和氨基酸组成无关。肽键的测定是蛋白质3.3双缩脲法，3.4BCA法，原则：在碱性条件下，蛋白质与Cu2络合还原为Cu，Cu与BCA试剂络合，在原来的苹果绿色中形成稳定的紫色蓝色复合物，在562nm中，吸光度和蛋白质浓度形成广泛的线性关系。2.2-二辛可宁酸，3.4BCA法，3.5康马斯青铜蓝法，原理：在自由状态下用红色有机染料，在稀酸溶液中结合蛋白质的碱性氨基酸和芳香氨基酸残基，变为蓝色，最大吸收波长从465nm变为595nm。A595与蛋白质含量成正比。CoomassiebrilliantblueG-250，石英杯，3.5考马斯亮蓝，3.6 uv分光光度法，原则：酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸的苯环包含共轭双键，在280nm处有吸收峰，吸光度，3.6紫外分光光度法，3.7荧光分光光度法，原则：溶液中含有表面活性剂时，荧光染料分子通过疏水相互作用形成二聚体或多聚体，由于大量体的形成，荧光强度降低。然后添加蛋白质溶液，分解聚合物，提高荧光强度。在特定蛋白质浓度范围内，荧光信号强度与蛋白质的浓度成正比。3.7荧光分光光度法，3.8蛋白印迹法，原理：通过电泳分离混合蛋白，将产物传至硝酸纤维膜，将固相载体中的蛋白质或多肽作为抗原，对该抗体进行免疫反应，与用酶或同位素标记的二次抗体反应，通过基质显色或放射性自身显影检测蛋白质成分。3.8蛋白印迹法，3.9高效液相色谱，原理：酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处吸收紫外线，