药学医学天然药物化学ppt课件-第五章 黄酮类化合物.ppt

银杏,银杏，别名公孙树，白果树，银杏古称“鸭脚木”因叶子很像鸭脚板而得名。,1932年一位日本人在银杏中首次发现了黄酮类化合物。,60年代，德国科学家发现银杏提取物中有通血脉和降低胆固醇药用成分。后来研究发现这一成分主要是银杏黄酮及银杏内酯类成分。这一重大发现极大地提升了银杏的药用价值，药理活性成分的研究也成为焦点。银杏制品适用于预防和治疗冠状动脉粥样硬化，心绞痛，血清胆固醇过高，痢疾，肠炎等。德国科学家通过银杏开发成新药，仅银杏叶制剂在美国年销售额就达到20亿美元。而我国尽管拥有全世界70%的银杏资源，产值却不到2000万美元。,银杏素R1=CH3,R2=H异银杏素R1=H,R2=CH3白果素R1=H,R2=H,第五章黄酮类化合物Flavonoids,主讲：白素平,第一节概述,黄酮类化合物是在植物中分布非常广泛的一类天然产物，在植物体内大部分与糖结合成苷类，也有一部分以游离态（苷元）的形式存在。由于最先发现的黄酮类化合物结构中都有一个酮式羰基，且又呈淡黄色或黄色，故称为黄酮。,黄酮类主要存在于高等植物及蕨类植物中，藻类、微生物（细菌）及海洋生物中没有发现黄酮类化合物存在。,黄酮类化合物对植物的生长、发育、开花、结果及防菌防病起着重要的作用。,黄酮类化合物生理活性多种多样，在国内外引起了的广泛重视，研究进展很快。仅截止到1974年为止，国内外已发表的黄酮类化合物共1674个，大多为黄酮醇和黄酮类。双黄酮类多局限分布于裸子植物，尤其松柏纲，银杏纲和凤尾纲等植物中。至2003年，黄酮类化合物总数已达到9000多个。近10年来，黄酮类化合物的研究已倾向于其药用价值的开发，更多的涉及提取分离工艺的应用研究、黄酮类化合物的含量测定及制剂等。,一、黄酮类化合物的定义：以前，黄酮类化合物(flavonoids)主要指基本母核2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)类化合物,色原酮（苯骈-吡喃酮）,2-苯基色原酮（黄酮）,1,2,3,4,7,6,5,8,1,2,3,4,7,6,5,8,1,2,3,4,6,5,A,B,C,现在的定义：黄酮类化合物则泛指两个苯环（A与B环）通过中央三碳链相互连接而成的一类化合物。,共同特征：C6-C3-C6基本骨架,A,B,C,二、黄酮类化合物的生物合成途径,研究表明，黄酮的基本骨架是由3个丙二酰辅酶A（丙二酸单酰辅酶A）和一个桂皮酰辅酶A生物合成。,A环,B环,Chalcones,查耳酮,二氢黄酮类,NOTE：黄酮类化合物大多在5，7，4位有-OH取代,黄酮骨架上常见取代基：-OH、OCH3、CH3、异戊烯基,黄酮类化合物的苷元的结构类型根据三碳链氧化程度不同、B环（苯基）连接位置（2-位或3-位）不同以及三碳链是否构成环分为以下不同的类型：,三、黄酮类化合物的结构分类,A,B,A,B,.黄酮类（Flavones）,基本结构,结构特征：三碳链成环C4，羰基C2=C3（双键）B环连接在C2位,基本结构上连接各种取代基，或OH（7-OH）与糖成苷，构成了系列黄酮类,分布:广泛分布于被子植物，唇形科、玄参科及菊科中较多。,如存在于金银花、忍冬藤中的木犀草素(luteolin)和忍冬苷，具有抗菌作用。,木犀草素,5,7,3,4-四羟基黄酮,新橙皮糖,（忍冬苷）,黄芩为清热解毒类中药，抗菌成分主要有根中的黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷、次黄芩素、黄芩新素、7-甲氧基黄芩素、7-甲氧基去甲基汉黄芩素等。黄酮,黄芩素,黄芩苷,汉黄芩素,汉黄芩苷,.黄酮醇类（Flavonols）,基本结构,结构特征：三碳链成环C4，羰基C2=C3（双键）B环连接在C2位C3，-OH取代,分布：该类化合物广泛分布于双子叶植物中，特别是一些木本植物的花和叶中存在较多,槐米为豆科植物槐SophorajaponicaL的干燥花蕾，其干燥成熟果实称槐角。槐米凉血止血、止咳祛痰，槐角清热泻火、润肠通便。主产于辽宁、河北、河南、山东、安徽及江苏等省，中国南北各地普遍栽培。槐米中含有槲皮素和芦丁。黄酮醇,槲皮素（quercetin）具有抗炎、止咳祛痰等作用，治疗支气管炎。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等作用。,斛皮素,芦丁(rutin)是槲皮素的-O-芸香糖苷。用于治疗毛细管脆弱引起的出血病，并用作高血压的辅助治疗剂。,芦丁,斛皮素,芸香糖,银杏和高良姜中的山奈酚，具有抗病毒作用,山奈酚,.二氢黄酮类(Flavanones),基本结构,结构特征：三碳链成环C4，羰基C2-C3（单键）B环连接在C2位手性碳,分布：该类化合物主要分布在被子植物中，以蔷微科、芸香科、豆科及姜科中这类化合物存较多。,陈皮中的橙皮苷和新橙皮苷，具有Vp样作用，维持血管的正常渗透压，减低血管脆性，高血压辅助治疗药。,甘草中的甘草素和甘草苷，对消化性溃疡具有抑制作用。,甘草素,甘草苷,4二氢黄酮醇类(Flavanonols),结构特征：三碳链成环C4，羰基C2-C3（单键）B环连接在C2位C3，-OH取代，手性碳,基本结构,分布：这类化合物主要存在双子叶植物中，豆科、蔷薇科；单子叶植物和裸子植物中也有少数存在。,如：水飞蓟种子中的水飞蓟宾（sylibin），是二氢黄酮醇与苯丙素衍生物缩合，黄酮木脂素类成分。,水飞蓟宾，具有保肝作用，临床上用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化及代谢中毒性肝损伤。,水飞蓟宾,如：黄柏中的黄柏苷，具有抗癌活性,黄柏苷（phellamurin）,5、异黄酮(Isoflavones),基本结构,结构特征：三碳链成环C4，羰基C2=C3（双键）B环连接在C3位,6.二氢异黄酮类(Isoflavanones),结构特征：三碳链成环C4，羰基C2-C3（单键）B环连接在C3位,基本结构,分布：异黄酮类和二氢异黄酮类这两类化合物主要存在被子植物中，尤其以豆科植物中较多（70），其余分布在鸢尾科和桑科植物中。异黄酮类化合物主要以大豆素及葛根素等较为常见；而二氢异黄酮类以鱼藤酮较为常见。,葛根总黄酮具有增加冠状动脉血流量及降低心肌耗氧量等作用，治疗冠心病。大豆素、大豆苷、葛根素能缓解高血压患者的头痛症状。,大豆素R1=R2=R3=H大豆苷R1=R3=H,R2=Glc葛根素R2=R3=H,R1=Glc大豆素7,4-二葡萄糖苷,R1=H,R2=R3=Glc,大豆素、染料木素、金雀花异黄素等异黄酮类具有雌激素样作用，与己烯雌酚结构相似。,R1=R2=H,大豆素R1=OH,R2=H,染料木素R1=OH,R2=CH3,金雀花异黄酮,己烯雌酚,毛鱼藤为我国南方广泛种植的植物，其中所含的鱼藤酮属于二氢异黄酮的衍生物。鱼藤酮具有较强的杀虫和毒鱼作用，当水中鱼藤酮的浓度为1：13000000时，足以使鱼昏迷死亡，对苍蝇的毒性比除虫菊强6倍，但对人畜无害，可用作农药杀虫剂。,鱼藤酮,7.查尔酮类（Chalcones）,结构特征：羰基=（双键）三碳链未成环,1,2,3,4,6,5,1,2,3,4,6,5,分布：这类化合物主要在豆科、菊科、苦苣苔科植物中存在较多。,如：中药红花中提取的红花苷,红花苷（黄色）,红花所含的色素红花苷是第一个发现的查耳酮类植物成分。,红花在开花初期，花冠呈无色(淡黄色)；开花中期，花冠呈深黄色；开花后期或采收干燥过程中由于酶的作用，氧化成红色。,二氢黄酮的吡酮环芳香性低，在碱的作用下易开环生成邻-羟基查耳酮，由无色转为深黄色，后者经酸化又能转化为原来的二氢黄酮。,查尔酮可视为二氢黄酮异构体，二者可相互转化。,8.二氢查耳酮类(Dihydrochalcones),结构特征：羰基（单键）三碳链未成环,二氢查耳酮类在植物界分布较少，如蔷微科梨属植物根皮和苹果种仁中含有的梨根苷，属于此类。,9.橙酮类(噢哢，Aurones),结构特征：羰基三碳链成五元环,橙酮类化合物在中药中少见，较多的存在于玄参科、菊科、苦苣苔科以及单子叶植物莎草科中.,例如，在黄花波斯菊花中含有的硫磺菊素属于此类。,10.花色素类(anthocyanidins),基本结构,结构特征：C4，无羰基C3=C4（双键）O=C1（双键）B环连接在C2位C3，-OH取代,花色素是使花、叶、果、茎等呈现蓝、紫、红等颜色的色素。以苷的形式存在于细胞液中，经水解可生成苷元花色素及糖。,飞燕草素,近年来，由于山楂花色素药理作用被发现后，花色苷的药理作用也引起注意。山楂提取物具有增加冠脉流量、降低胆固醇、中枢神经镇静作用，其有效成分为黄酮及三萜类，其中的花色苷对心脏起动阶段有强壮作用。,11.黄烷-3-醇(Flavan-3-ols)黄烷-3，4-二醇(Flavan-3,4-diols)类,黄烷-3-醇,黄烷-3，4-二醇,黄烷3-醇的衍生物称为儿茶素类（catechin），在植物界分布较广。主要存在于含鞣质的木本植物中。儿茶素为中药儿茶的主要成分，有儿茶素和表儿茶素，可用作抗肝毒药物。也有抗癌活性。,12.双苯吡酮类(xanthanes),分布：该类化合物广泛分布于龙胆科、藤黄科和百合科植物中。,口山酮类苯骈色原酮类,如石韦、芒果叶和知母叶中的异芒果素，就属于此类，该化合物具有止咳祛痰的功效。,13.高异黄酮类化合物(Homoisoflavones),如，存在中药麦冬中的麦冬高异黄酮A,高异黄酮类母核比异黄酮母核C环与B环间多一个CH2,14.双黄酮类化合物,双黄酮类集中分在布裸子植物中，如银杏科、松科、杉科，蕨类植物的卷柏属中也有分布。,银杏素R1=CH3,R2=H异银杏素R1=H,R2=CH3白果素R1=H,R2=H,四、天然黄酮苷类化合物,1.形成黄酮苷的糖类,单糖：,D-葡萄糖（D-Glc）、D-半乳糖（D-Gal）、D-甘露糖（D-Man）、D-木糖（D-Xyl）、L-鼠李糖（L-Rha）、L-阿拉伯糖（L-Ara）、,酰化糖类：,2-乙酰基葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖,二糖类：,芸香糖(rha16glc)、龙胆二糖(glc16glc)、槐糖（glc12glc）、新橙皮糖（rha12glc）、刺槐二糖（rha16gal）等。,叁糖类：龙胆三糖(glc16glc12fru)、槐三糖(glc12glc12glc)等。,黄酮苷中糖的联接位置与苷元的结构类型有关。如黄酮醇类常形成3-，7-，3-，4-单糖苷，或3，7-，3，4-及7，4-双糖链苷等。但是，一般不在5-位成苷，因成氢键。,2.黄酮苷中糖的连接位置,3-，7-，3-，4-易成苷,5-位不易成苷,2.黄酮苷的苷键类型,天然黄酮类大多为O-糖苷，也有C-糖苷。如葛根素，葛根黄素（Puerarin）和葛根黄素木糖苷(Puerarinxyloside)等为C-糖苷。,五、黄酮类化合物的生物活性,1.对心血管系统的作用,Vp样作用：芦丁、橙皮苷等有Vp样作用，能降低血管脆性及异常通透性，可用作防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂。,扩冠作用：芦丁、槲皮素、葛根素、人工合成的立可定。,降血脂及胆固醇：木樨草素,芦丁片,芦丁是从中国所独有的国槐的花蕾中提取的植物药，也称维生素P，具有降低毛细血管的异常通透性和脆性的作用，是心脑血管保护药，国内用于心脑血管药品制剂的主要成分，国外还大量用于食品添加剂和化妆品。,2.抗肝脏毒作用,从水飞蓟种子中得到的水飞蓟素具有保肝作用，用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化及多种中毒性肝损伤。,（+）-儿茶素(catergen)也可抗肝脏毒作用，治疗脂肪肝及因半乳糖胺或四氯化碳等引起的中毒性肝损伤。,水飞蓟,水飞蓟片,本品为菊科植物水飞蓟（紫花）的果实经提取精制所得的淡黄色粉末或结晶性粉末。无味无臭，其主要成分为水飞蓟宾(Silybin)、水飞蓟亭、水飞蓟宁等，是一种易溶于丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙醇等溶剂，难溶于氯仿，不溶于水的黄酮类物质。国内外好多医药厂家现已制成片剂、胶囊，取名水飞蓟片、利肝素等，经临床应用，亦取得了好评，很受国内外肝病患者欢迎。,它能改变肝细胞膜通透性，加速肝细胞再生，还有解毒、缓释血脂等作用，对于治疗慢性肝炎、早期肝硬化、代谢中毒性肝损伤、高血脂等症有很不错的疗效。,3.抗炎,4.抗菌及抗病毒作用,5.解痉作用,芦丁及其衍生物羟乙基芦丁、二氢槲皮素等具有抗炎作用,如木樨草素、黄芩苷、黄芩素；,异甘草素、大豆素：解除平滑肌痉挛,6.雌性激素样作用,大豆素(daidzein)等异黄酮具有雌性激素样作用,7.清除人体自由基作用,黄酮类化合物多具有酚羟基，易氧化成醌类而提供氢离子，故有显著的抗氧特点。,8.泻下作用如中药营实中的营实苷A就有泻下作用。,9.抗肿瘤作用,研制与发现的抗癌新药Flavopiridol就是一类黄酮类化合物，Flavopiridol是一种源于植物（Cdysoxylumbinectariferum）的黄酮类化合物，在大规模抗癌物筛选中，Flavopiridol脱颖而出，成为一种新的低毒性的研究药物。目前正被用于一期和二期的癌症临床试验。最近，不同的研究者证实其对艾滋病也有异于其他药物的疗效。它的早期发现得益于工业界对天然产物的研究兴趣。在从树皮中提取出纯化合物后，HOECHST公司又进行了结构与人工合成的研究。,第二节黄酮类化合物的理化性质及显色反应,一、性状,1.多为结晶性固体，少为（如黄酮苷类）无定形粉末,2.旋光性：游离苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮、黄烷、黄烷醇及双黄酮都有不对称碳原子，具有旋光外，其余无旋光性。苷类由于结构中引入糖的分子，均有旋光性，且多为左旋。,3.颜色：,例如：色原酮部分原本无色，但在2位引入苯环后，即形成交叉共轭体系，且通过电子的转移，重排，使共轭链延长，而表现出颜色。,分子中是否存在交叉共轭体系;助色团的数目多少；取代基的位置有关。,其中，黄酮、黄酮醇及其苷类、查耳酮等因分子中存在交叉共轭体系，黄色橙色。,在7,4位引入-OH,OCH3等助色基团，使化合物颜色加深。其它位置影响小。,如果C2、C3间的双键被氢化，则交叉共轭体系被中断，以致使二氢黄酮及二氢黄酮醇几乎无色，异黄酮共轭很少，仅显微黄色。,黄酮、黄酮醇及苷类灰黄-黄色查耳酮黄-橙黄色二氢黄酮、二氢黄酮醇无色异黄酮微黄色,各类黄酮类化合物呈现的颜色：,花色苷及其苷元的颜色随pH的不同而改变：呈现红色(pH8.5)。,二、溶解性,1.游离苷元难溶或不溶于水，易溶于MeOH,EtOH,EtOAc,Et2O.黄酮、黄酮醇及查耳酮是平面型分子，分子堆砌紧密，分子间引力较大，更难溶于水.,二氢黄酮、二氢黄酮醇是非平面型分子，分子排列不紧密，分子间引力降低，对水的溶解度较大。,花色苷元（花青素）类虽系平面型分子，但因以离子形式存在，具有盐的通性，故亲水性较强，水溶度较大。,X-orOH-,黄酮苷元引入羟基越多，水溶性越强，羟基甲基化后，则增加在有机溶剂中的溶解度。,2.黄酮苷类黄酮化合物的羟基苷化后，水溶性相应增大，而在有机溶剂中的溶解度相应减小。,黄酮苷一般易溶于H2O,MeOH,EtOH等，难溶或不溶于苯，氯仿等。,三、酸碱性,1.酸性黄酮类化合物多具有酚羟基而呈酸性，可溶于碱性水溶液，吡啶，甲酰胺及二甲基甲酰胺。酸性强弱顺序：7,4-二羟基7,或4羟基一般酚羟基5-羟基此性质可用于提取、分离及鉴定工作。,7,4-二羟基7,或4羟基一般酚羟基5-羟基,原因,2.碱性,-吡喃酮上的1-位氧原子上有未共用电子对，表性微弱的碱性，可与强无机酸如浓硫酸，盐酸生成烊盐，但极不稳定，加水即可分解。,黄酮类化合物溶于浓硫酸中生成的烊盐常表性特殊的颜色，可用于鉴别。,黄酮类化合物溶于浓硫酸，烊盐表现特殊的颜色,黄酮、黄酮醇类化合物：显黄色橙色，并有荧光；二氢黄酮类化合物：显橙(冷时)紫红色(热时)；查尔酮类化合物：显橙红洋红色；异黄酮、二氢异黄酮类化合物：显黄色；橙酮类化合物：显红洋红色。,四、显色反应,1.盐酸-镁粉（盐酸-锌粉）反应此反应是鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应。方法：将样品溶于1ml甲醇液中，加入少许镁粉（或锌粉）振摇，滴加几滴浓HCl，1-2min内(必要时加热)即可显示不同的颜色。多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇化合物显橙红紫红色，少数显紫蓝色。查耳酮、橙酮、儿茶素不显色，异黄酮一般不显色,2.四氢硼钠（钾）反应：NaBH4是对二氢黄酮类化合物专属性较高的一种还原剂。与二氢黄酮类化合物产生红紫色。与其他黄酮类化合物均不显色，可与其它黄酮类化合物相区别。近年来报道二氢黄酮类化合物还可与磷钼酸试剂发生反应，使颜色呈现棕褐色，也可作为二氢黄酮类化合物的特征鉴别反应。,3.金属盐的络合反应：黄酮类化合物分子结构中多有5-OH,4=O;3-OH,4=O;邻二酚羟基，常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐、锶盐等试剂生成有色络合物。,Al3+Pb2+Zr4+Mg2+Sr2+,(2)铅盐：1%Pb(OAc)2或碱式醋酸铅水溶液。生成黄-红色沉淀。醋酸铅可沉淀具有邻二酚羟基或兼有3-OH,4=O或5-OH,4=O者。碱式醋酸铅沉淀能力大，一般酚类均可沉淀，不仅用于鉴定，亦可用于分离。,(1)铝盐：1%AlCl3或Al(NO3)3，生成络合物为黄色(max=415nm)，并有荧光。,(3)锆盐:2%二氯氧锆甲醇液，ZrOCl2,上述反应也可在滤纸上进行，得到的锆盐络合物大多呈现黄绿色，并带有荧光，反应得到的络合物结构如下：,黄绿色，并有荧光,(4)镁盐醋酸镁甲醇液作显色剂，可在纸上进行。二氢黄酮（醇）类显天蓝色荧光，若具有C5-OH，色泽更明显。而黄酮、黄酮醇及异黄酮类则显黄-橙黄-褐色。,(5)氯化铁(FeCl3)检查酚羟基。多数黄酮类化合物具有酚羟基，可产生阳性反应，生成绿、蓝、黑、紫等颜色的溶液。,(6)氨性氯化锶(SrCl2)在氨性甲醇溶液中，氯化锶使具有邻二酚羟基的黄酮显绿-棕色-黑色沉淀。此反应是鉴定黄酮类化合物最常用的邻二酚羟基的特征性鉴别反应。,邻二酚羟基,4.硼酸显色反应,条件：a.具有下列结构(5-羟基黄酮，2-羟基查耳酮)b.有无机酸或有机酸存在,现象：在草酸存在下，显黄色并带绿色荧光在枸橼酸丙酮存在条件下，只显黄色而无荧光,5.碱性试剂显色反应,二氢黄酮类：在碱液中开环，转变成相应异构体查耳酮类化合物，显橙-红色。,(2)黄酮醇类：在碱液中先呈黄色，通入空气后变为棕色，据此可与黄酮类区别。,无色,橙-红色,(3)黄酮类：当分子中有邻二酚羟基取代或3,4-二羟基取代时，在碱液中不稳定，很快氧化，由黄色深红色绿棕色沉淀。,6.与五氯化锑的反应,查耳酮的无水(!)CCl4溶液与五氯化锑作用生成红或紫红沉淀;黄酮、黄酮醇、二氢黄酮类显黄-橙黄色。反应必须无水，否则生成沉淀不稳定。,7.Gibbs反应,Gibbs试剂:甲液：0.5%2,6-二氯苯醌-4氯亚胺乙醇溶液。乙液：硼酸-氯化钾-氢氧化钾缓冲液(pH9.4)检查5-OH对位未被取代的黄酮。将样品溶于吡啶中，加入Gibbs试剂显蓝或蓝绿色。,第三节黄酮类化合物的提取分离,一、提取,在木部坚硬组织中，多以游离苷元形式存在在花、果等组织中，多以苷的形式存在,根据化合物极性不同，溶解性不同，采用不同溶剂提取。,一般多用CHCl3、Et2O、EtOAc等极性较小溶剂提取；对于含有-OCH3多的黄酮类化合物的苷元成分，用苯、石油醚提取；对于极性大的苷元成分，如查耳酮、双黄酮、羟基黄酮等，多采用EtOAc、EtOH、Me2CO、MeOH、H2O、MeOH:H2O=1:1等溶剂提取。,1.黄酮类化合物苷元的提取,2.黄酮苷类的提取,水或热水提取，(多糖苷在热水中溶解度较大，在冷水中溶解度较小)；也可用EtOH、MeOH、EtOAc提取。,3.含酚羟基的苷或苷元,可用碱水提取。,4.提取花青素类可加入少量酸，但一般黄酮苷类化合物则应避免，以免发生水解反应。有时为避免发生水解反应，提取苷时事先破坏酶的活性。,6.常用的几种提取方法,（1）热水提取法：,如，淫羊藿总黄酮的提取。采用正交实验对其提取工艺进行了多因素研究，得出适合于大生产的最佳工艺参数为，加20倍水、浸泡1h、煎煮2次，每次1h。,用于各种黄酮苷的提取。常将原料投入沸水中破坏酶的活性。缺点：提取杂质多优点：成本低、安全，适合于工业化大生产。,（2）乙醇或甲醇提取法：高浓度醇（9085），提取苷元。低浓度醇（60），提取苷。如：广枣总黄酮的提取，8倍量的70乙醇回流1h，提取两次，得率可达90。,（3）系统溶剂提取法：极性由小到大溶剂依次提取石油醚或己烷脱脂。苯提取多甲氧基黄酮或含异戊烯基、甲基黄酮。乙醚、氯仿、乙酸乙酯依次提取多数苷元。丙酮、乙醇、甲醇、水（1:1）提取多羟基黄酮、双黄酮、查耳酮。稀醇、沸水提取苷类。1HCl提取花色素。,（4）碱性水或碱性稀醇提取：适合有酚羟基的黄酮的提取。常用碱性水溶液，如：NaCO3、NaOH、Ca(OH)2（石灰乳）水溶液。石灰乳提取适合于花、果等含大量果胶、黏液质等水溶性杂质的药材，可以使含羧基的杂质生成钙盐沉淀，达到初步纯化的目的。如，槐米中斛皮素和芦丁的提取。,二、粗提物的精制处理,1.溶剂萃取法去杂质石油醚：除去叶绿素、胡罗卜素等脂溶性色素;水提醇沉：除去蛋白质、多糖、大分子水溶性物质逆流分配：水-乙酸乙酯，正丁醇-石油醚;在萃取除杂的同时，可使不同极性或极性相差较大者分离，如极性不同的苷和苷元，极性苷元和非极性苷元。,2.碱提酸沉法,适用于含酚羟基的化合物，如槐米中芦丁的提取。注意事项：酸碱度不宜过大;邻二酚羟基的保护：碱性条件下，邻二酚羟基易被氧化，加硼砂保护;石灰乳的加入可除去果胶、粘液等水溶性酸性杂质,适用于苷类的精制植物的甲醇提取液加活性炭至吸附完全，过滤得吸附苷的活性炭粉末。依次用沸甲醇、沸水、7%酚/水、15%酚/醇洗脱，分步收集、检查、合并。大部分苷类可用7%酚/水洗下，经减压浓缩至小体积，乙醚除残留的酚，余下水层经减压浓缩得较纯黄酮苷。,3.炭粉吸附法,(1)聚酰胺层析：柱填充剂主要有锦纶6(聚己内酰胺型)、锦纶66(聚己二酰己二胺型)、聚乙烯吡咯烷酮型三种。原理:酰胺羰基与黄酮酚羟基形成氢键缔合吸附，吸附能力与酚羟基多少、位置及氢键缔合力大小有关。,1、极性大小不同，利用吸附或分配原理进行分离:,常用吸附剂有聚酰胺、硅胶、葡聚糖凝胶和纤维素粉。,三、黄酮类化合物的分离,（1）与黄酮类化合物分子中能形成氢键的基团数目多少有关，形成氢键的基团数目越多，则吸附力越强。,（2）与黄酮类化合物分子中能形成氢键的基团位置有关，羟基易形成分子内氢键，则吸附力越小。,（3）分子内芳香化程度越高，共轭双键越多，则吸附力越强。,各种溶剂在聚酰胺柱上洗脱能力由弱至强依次为：水，甲醇，丙酮，氢氧化钠水溶液，甲酰胺，二甲基甲酰胺，脲素水溶液。,黄酮类化合物从聚酰胺柱洗脱时有下列规律：,苷元相同，洗脱先后顺序一般为：,三糖苷双糖苷单糖苷苷元,母核上增加羟基，洗脱速度相应减慢,不同类型的黄酮类化合物，先后流出顺序一般是：,异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇,分子中芳香核、共轭双键多者吸附力强，故查耳酮往往较相应的二氢黄酮难于洗脱。,分子中羟基数目相同时，羟基位置的影响：在羰基邻位羟基黄酮具有对位（或间位）羟基黄酮,聚酰胺对羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故邻位羟基（氢键）者先被洗出。,NOTE：聚酰胺柱分离常常存在两个缺点：冲洗速度慢用含甲醇的溶剂洗脱时，所得到的黄酮类化合物中含有分子量的聚酰胺。解决方法：冲洗速度慢可用筛筛去细粉或与硅藻土(1:2)混合装柱，以及加压或减压冲柱等方法克服。,(2)硅胶柱层析,对酚羟基多的黄酮类，如多羟基黄酮及其苷类，硅胶减活性使用；,对酚羟基少的黄酮类，如甲基化、乙酰化黄酮及二氢黄酮、异黄酮，则无须减活性。,分离黄酮苷元时，用氯仿-甲醇混合溶剂作洗脱剂，分离黄酮苷时，可用氯仿-甲醇-水（80：20：2）作洗脱剂效果较好。,2.用葡聚糖凝胶分子筛分离,主要用两种型号的凝胶Sephadex-G和Sephadex-LH20分离游离黄酮主要是吸附作用，极性小大洗脱；分离黄酮苷类，作用是分子筛，分子大洗小脱；总的洗脱顺序：糖多的苷糖少的苷游离苷元（极性小大）常用洗脱剂：碱性水溶液，含盐水溶液;醇及含水醇；含水丙酮，甲醇氯仿；,凝胶对苷元吸附力的大小取决游离酚羟基的数目的多少，酚羟基数少，极性相对较小，吸附力也小，先被洗出。,.pH梯度萃取法,混合物溶于有机溶剂，依次用NaHCO3、Na2CO3、0.2%NaOH、4%NaOH萃取，相应的黄酮类化合物洗脱顺序：7,4-二羟基7或4羟基一般酚羟基-羟基黄酮。,.根据分子中某些特定官能团进行分离,醋酸铅沉淀法,硼酸络合法,在中药的甲醇提取液中加入饱和的中性醋酸铅水溶液，可使具有邻二酚羟基或羧基的黄酮类化合物沉淀析出，如果中药的甲醇提取液中所含的黄酮类化合物不具有上述结构，则加入醋酸铅沉淀的为杂质，过滤除去即可。,醋酸铅沉淀法,例如：从芹菜ApiumgraveolensL.种子中分离graveobiodideA及B,其分离工艺如下：,硼酸络合法：根据具有邻二酚羟基的黄酮与硼酸络合，生成物易溶于水的性质与其它类型黄酮分离。,通常在不与水混溶的有机溶剂如乙醚中，用硼酸液萃取，水相即为邻二酚羟基类黄酮。,第四节黄酮类化合物的检识与结构测定,目前主要采用的方法有：与标准品或与文献对照PC或TLC得到的Rf值分析对比样品在甲醇溶液中及加入酸、碱或金属盐类试剂（诊断试剂）后得到的UV光谱波谱法：1H-NMR；13C-NMR；MS；UV；IR,一、色谱法在黄酮类鉴定中的应用,1.纸层析(PC),苷类成分可采用双向展开，第一相展开采用醇性溶剂，如BAW系统（nBuOH:HOAc:H2O(4:1:5上层）；第二相展开用水性溶剂，如CHCl3:HOAc:H2O（3:6:1）苷元则多采用醇性溶剂。花色苷及其苷元，可用含盐酸或醋酸的溶剂。,2.薄层层析(TLC),（）硅胶薄层,用于鉴定弱极性黄酮较好，主要是苷元，也有黄酮苷类。常用展开剂：甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5：4：1）苯：甲醇（95：5）苯：甲醇：冰醋酸（35：5：5）,（）聚酰胺层析,适用范围广：适合于含游离酚羟基黄酮苷元或其苷类。常用展开系统：乙醇:水(3:2）;丙酮:水(1:1）,紫外光2%三氯化铝甲醇液1%FeCl3/1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液,显色剂,二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用,可确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含有羟基。,一般程序：,测定样品在甲醇中的UV谱以了解母核类型；,在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测UV谱,以了解3,5,7,3,4有无羟基及邻二酚羟基；,苷类可水解后(或先甲基化再水解)，再用上法测苷元的UV谱以了解糖的连接位置。,（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱,1、多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成：,带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃迁所引起；,带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起。,BandI300-400,BandII240-280,带II在240-280nm,带I在300-400nm,取代基的位置：,A环上的取代基对带II峰位和峰形;,B环上的取代基对带I峰位和峰形;,C5,C3-OH对带I和带II峰位和峰形？,取代基的种类的影响：,羟基可以使相应的吸收峰红移，若羟基被苷化，与羟基相比吸收峰红移减少。,取代基的数量：,B环含氧取代基的数量越多，对带I吸收的影响就越大，带I红移越多。但不能使带II产生红移。,（1）取代基对吸收峰的影响,因羟基能与C4O形成氢键，C3-OH使带I红移，C5-OH使带I、II均红移。,（2）各类黄酮类化合物的紫外吸收光谱,A、黄酮类及黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征,两者基本图谱的异同点：相同点：UV相似，出现两个吸收峰，图形相似，吸收强度相近；不同点：黄酮：带峰304350nm黄酮醇：带峰352385nm,注意点：若3-OH甲基化或苷化后，使黄酮醇类化合的带I峰紫移，带I峰位于320357nm，需注意与黄酮类化合物相区别，这时要考虑用NMR谱。,黄酮：304-350,黄酮醇：352-385,黄酮醇（OH取代）：328-357,B、异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇类UV光谱特征,峰形：基本相同？带的吸收峰强,而带I的以肩峰或低强度的吸收峰出现，易与黄酮类、黄酮醇类、查耳酮及橙酮类相区别。,峰位：异黄酮类带：245270nm二氢黄酮带：270295nm二氢黄酮醇带：270295nm,270nm25,C、查耳酮及橙酮类UV光谱特征,峰形：带均为主峰且强度很高，带为次强峰，可与上述几黄酮类化合物类相区别。,峰位：查耳酮类带:340390nm;橙酮类带：370430nm,不同类型黄酮类化合物的紫外光谱,(橙酮类）,Band,Band,结论：,根据不同类型的黄酮类化合物带I或带II峰位、峰形、吸收强度以及它们的紫外光谱特征可以大致推测黄酮类化合物的结构类型。,（二）加入诊断试剂后引起的位移及结构测定,(1)诊断试剂的定义：,通过加入某些试剂，使化合物中的酚羟基全部或部分解离，或形成络合物，使光谱发生规律性的变化，用于判断化合物的结构，因这些试剂对化合物的结构具有诊断意义，故称为诊断试剂。,(2)常用的诊断试剂：,甲醇钠(NaOMe)：碱性较强，可以使黄酮类化合物所有酚羟基解离，使相应谱带大幅度红移。,乙酸钠(NaOAc)：碱性小于甲醇钠，只能使酸性较强的酚羟基（如7-OH）解离，使谱带红移。,乙酸钠-硼酸(NaOAc-H3BO3)：硼酸在碱性条件下与邻二酚羟基络合，使相应谱带红移。,三氯化铝(AlCl3)：可与有3-OH,C4=O、5-OH,C4=O或邻二酚羟基的黄酮或黄酮醇类作用生成络合物，使相应谱带红移。,三氯化铝-盐酸(AlCl3-HCl)：使邻二酚羟基生成络合物而分解，使相应光谱与AICl3比较，发生紫移。,甲醇钠(NaOMe)：用于3-OH,7-OH,4-OH的确定黄酮UV首先在MeOH液中测定，再加NaOMe后;带红移4060nm，如果强度不变或略增加，则示有4OH带红移5060nm，如果强度下降，则示有3OH，而无4OH,(3)诊断试剂与化合物结构的关系,以黄酮和黄酮醇为例（与MeOH中UV比较）：,如果7-OH游离，则在320-330nm处有吸收；如果7-OH结合成苷后，则该吸收即消失。,乙酸钠(NaOAc)：主要是用于判断7-OHNaOAc只能使酸性较强的酚羟基解离，导致相应的吸收带红移，主要反应的是A环的取代情况。如果有7-OH，则带特征性的红移5-20nm,乙酸钠-硼酸(NaOAc-H3BO3)：判断邻二酚羟基A、B环上如果有邻二酚羟基时，在NaOAc碱性条件下可与H3BO3络合，使吸收带红移。B环有邻二酚羟基时，带红移1230nmA环有邻二酚羟基时，带红移510nm,(4)三氯化铝(AlCl3)和三氯化铝-盐酸(AlCl3/HCl)：可与具有3-OH，C4=O、5-OH，C4=O或邻二酚羟基的黄酮或黄酮醇类化合物作用生成络合物，使和谱带红移。加入盐酸后，邻二酚羟基络合物分解，使相应的吸收带紫移。形成络合物的稳定性:3-OH5-OH邻二酚羟基,和带吸收峰变化如下：,AlCl3光谱=AlCl3/HCl光谱：A,B环皆无邻二酚羟基AlCl3光谱AlCl3/HCl光谱:A,B环皆可能有邻二酚羟基峰带:紫移30-40nmB环上有邻二酚羟基紫移50-65nmA,B环均可能有邻二酚羟基MeOH图谱AlCl3/HCl图谱：示无3-OH及5-OHMeOH光谱AlCl3/HCl光谱:可能有3-OH及5-OH峰带:红移35-55nm只有5-OH红移60nm只有3-OH红移50-60nm可能同时有3-OH及5-OH,三、1H-NMR,常用溶剂：氘代氯仿（CDCl3），氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），氘代吡啶（C5D5N）。,1HChemicalShift：7.22,7.58,8.7413CChemicalShift：123.9,135.9,150.2,1HChemicalShift：2.5013CChemicalShift：39.5,1HChemicalShift：7.2713CChemicalShift：77.23,DMSO-d6：羟基质子信号容易出现如3,5,7-三羟基黄酮5-OH：12.407-OH：10.933-OH：9.70,17-OH黄酮,H-5较H-6、H-8低场，是由于羰基的负屏蔽效应的影响。H-6、H-8(6.4-7.1ppm)较5,7-二OH黄酮H-6、H-8低场，且相互位置可能颠倒。,（一）A环质子,H-5,H-6,7.908.20d,6.707.10dd,6.707.00d,H-8,25,7-二OH黄酮,当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低场方向位移。,5OH：12ppm7OH：11ppm,6.006.20,6.306.50,8,6,6.206.40,6.506.90,(二)B环质子(6.5-8ppm),1.4-氧取代黄酮类化合物,原因是由于C环对H-2,6的负屏蔽作用以及4-OR对H-3,5屏蔽作用，故前者较低场；C环氧化程度越高，H-2,6处于越低场的位置。,H-3,56.5-7.1,d,J=8.5HzH-2,67.1-8.1,d,J=8.5Hz,比A环质子低场,7.707.90d,6.507.10d,2.3,4-二氧取代黄酮及黄酮醇类,H-2受C环负屏蔽和3-OR屏蔽作用，H-6也受C环负屏蔽作用，而H-5则仅4-OR屏蔽作用。故由低场到高场的顺序为：H-6H-2H-5。但有时也会发生H-2和H-6重叠的现象。,H-56.7-7.1，d,J=8.5HzH-27.2，d,J=2.5HzH-67.9，dd,J=2.5,8.5Hz,B,6.7-7.1d,7.207.30d,7.307.50dd,B,3.3,4-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇,H-2,5,6常作为一个复杂多重峰（通常为两组峰）出现在6.7-7.1ppm的区域内。此时C环对其影响很小，各质子的化学位移将主要取决于它们相对于含氧取代的位置。,H-2,5,66.7-7.1ppm,6.7-7.1ppm,4.3,4,5-三氧取代黄酮类化合物,若R1=R2=R3=H时，则H-2,6为单峰，出现在6.7-7.5ppm，若3-OH或5-OH甲基化或苷化时，则H-2,6分别以不同的化学位移作为一个二重峰(J=2Hz)出现。,B,6.7-7.5ppm,（三）C环质子,1.黄酮类,H-3,尖锐的单峰信号,6.3-6.8ppm处。因此，在5,6,7-或5,7,8-三含氧取代黄酮中，它将与A环的孤立芳氢（H-8或H-6）的单峰信号相混，应当注意区别。,C,其特征是区别各类黄酮的依据,6.3ppm,6.3ppm,2.异黄酮类,H-2位于羰基位，受羰基的共轭和苯环的负屏蔽作用，且通过碳与氧相连，故较一般芳香质子低场，7.6-7.8ppm，单峰（s）。若用DMSO-d6作溶剂，则8.5-8.7ppm。,C,3.二氢黄酮和二氢黄酮醇,两个H-3因相互偕偶(J17Hz偕偶)，且与H-2邻偶，分别为dd峰，中心位于2.8ppm处。,H-2与两个磁不等同H-3偶合，H-2：dd,5.0-5.5ppm,Jtrans=11.0Hz(反偶)Jcis=5.0Hz（顺偶）,（1）二氢黄酮,(2)二氢黄酮醇,3-OH苷化，H-2与H-3的值升高(向低场位移)，可用于判断二氢黄酮醇苷中糖的位置。,在天然存在的二氢黄酮醇中,H-2与H-3为反式双直立键，J2,3=11Hz,H-2,4.9(4.8-5.0)ppmd,H-3,4.3(4.1-4.3)ppmd,4.80-5.00,d,J2,3=11Hz,4.10-4.30d,4.查耳酮,5.橙酮,6.50-6.70ppm,s若用DMSO-d6作溶剂，则6.37-6.94ppm,端基质子(1-H)：4.0-6.0ppm与糖的类型、构型、在苷元上的位置有关,其余质子信号：3.2-4.2ppm,化学位移规律：,甲基信号（甲基五碳糖）：1.0ppm左右,（四）糖上的质子,黄酮苷类化合物上糖端基质子信号,化合物糖上H-1,黄酮醇-3-O-葡萄糖苷5.706.00黄酮类-4-O-葡萄糖苷黄酮类-5-O-葡萄糖苷4.805.20黄酮类-7-O-葡萄糖苷黄酮类-6-及8-C-糖苷黄酮醇-3-O-鼠李糖苷5.005.10二氢黄酮醇-3-O-葡萄糖苷4.104.30二氢黄酮醇-3-O-鼠李糖苷4.004.20,化合物糖上H-1,黄酮醇-3-O-葡萄糖苷5.706.00黄酮类-4-O-葡萄糖苷黄酮类-5-O-葡萄糖苷4.805.20黄酮类-7-O-葡萄糖苷黄酮类-6-及8-C-糖苷,显然，对于黄酮类化合物葡萄糖苷来说，C-3-OH上连接的糖可以很容易地与C-4、C-5及C-7-OH上连接的糖相区别。,化合物糖上H-1,黄酮醇-3-O-葡萄糖苷5.706.00黄酮醇-3-O-鼠李糖苷5.005.10,黄酮醇-3-O-葡萄糖苷与3-O-鼠李糖苷可以很容易区别。,葡萄糖苷与鼠李糖苷的区别,鼠李糖上的C-CH30.8-1.2,d,J=6.5Hz,苷键构型：葡萄糖苷，1-H偶合常数确定J=6-8Hz，-苷键；J=2-4Hz，-苷键鼠李糖苷，1-H偶合常数，无法确定构型,2.双糖苷类,黄酮类化合物双糖苷中，末端糖上的H-1因离黄酮母核较远，受到的负屏蔽作用较小，因而共振峰将移至比H-1较高场的位置。但移动程度则因末端糖的连接位置不同而不同。,H-1较H-1在高场,芸香糖基,（五）6-及8-C-CH3质子,6-CH3:H,2.042.27,s,8-CH3:H,2.142.45s,6-C-CH3质子信号恒定地出现在比8-C-CH3质子小约0.20ppm,四、13C-NMR,(一)骨架类型的判断,根据中央三碳链的碳信号，先根据羰基碳值，再结合C2、C3的裂分和值判断。,（二）黄酮类化合物取代图式的确定方法,黄酮类化合物中芳香碳原子的信号特征可以用来确定取代基的取代图式。,以黄酮为例，其13C-NMR信号如下所示：,1取代基位移的影响,-OH及-OCH3的引人将使直接相连碳原子(-碳)信号大幅度地向低场位移，邻位碳原子(-碳)及对位碳则向高场位移。间位碳虽也向低场位移，但幅度很小。,注意：A环取代基，位移效应只影响A环B环取代基，位移效应只影响B环,5-OH：影响A环，影响C4（4.5）、C3（2.0）,4.5,2.0,对大多数5,7-二羟基黄酮类来说，C-6(d)及C-8(d)信号在90100ppm内出现,且C-6信号总是比C-8信号出现在较低的磁场;在二氢黄酮中，C-6(d)及C-8(d)两者信号相差较小,约差0.9ppm;在黄酮及黄酮醇中两者相差较大，约为4.8ppm。但具体的可以通过二维核磁NMR得到确认。,25，7-二羟基黄酮类中C-6及C-8信号的特征,C-6或C-8有无烷基取代或芳香基取代可通过观察13C-NMR上C-6，C-8信号是否发生位移而加以确认。,可以看到：被甲基取代的碳原子将向低场位移6.0-9.6，但未被取代的碳原子信号无大的改变。,木犀草素(1uteolin)，即使因其C6上联接的H被-OH取代而向低场大幅度的位移，C-8信号也未因此而发生大的改变。,(三)黄酮类化合物-O-糖苷中糖的连接位置,1糖的苷化位移及端基碳的信号,黄酮苷类化合物当苷化位置在苷元7或2、3、4时，糖的C-1信号将位于约100.0102.5范围内。,5-O-葡萄糖苷及7-O-鼠李糖苷相应的C-1信号分别出现104.3及99.0处。,酚性苷中，糖上端基碳的苷化后位移大约为+4.0+6.0,2.苷元的苷化位移,苷元糖苷化后与糖直接相连碳原子（ipso-C）向高场位移，其邻位及对位碳原子则向低场位移，且对位碳原子的位移幅度大而且恒定。,C-5-OH糖苷化后，除上述苷化位移效应外，还因C5-OH与C4O的氢键缔合受到破坏，故对C环碳原子也将发生巨大的影响。C-2,C-4信号明显地向高场位移，而C-3信号则移向低场。如：7-OH、3-OH、3-OH及4-OH糖苷化后均可出现上述情况。,五、质谱在黄酮类结构测定中的应用,多数黄酮类化合物苷元在电子轰击质谱(El-MS)中因分子离子峰较强，往往成为基峰，故一般无须作成衍生物即可进行测定。但当测定极性强、难以气化及以热不稳定的黄酮苷类化合物时，如不预先作成甲基化或三甲基化硅烷衍生物，则在电子轰击质谱(El-MS)中将看不到分子离子峰。,然而如果是测定极性强、难气化以及对热不稳定的黄酮苷类化合物时，可以采用FD-MS和FAB-MS、ESI-MS等软电离质谱技术获得强的分子离子峰M+。,(一)黄酮类化合物苷元的电子轰击质谱(El-MS),黄酮类化合物苷元的El-MS中，除分子离子峰M+外，也常常生成M-1+即(M-H)基峰。黄酮类化合物来说，由两种基本裂解途径得到的碎片离子，A1+、B1+、B2+等，因为保留着A-及B-环的基本骨架，在鉴定上很有意义。,黄酮类化合物主要有下列两种基本裂解途径：,途径-I（RDA裂解）：,A1+B1=M,途径-II,此外，还有分子离子M+生成M-1+，(M-H)及M-28+，(M-CO)；由A1生成M-28+，(A1-CO)及B2生成B2-28+，(B2-CO)等碎片离子。,105,1黄酮类裂解基本规律：,A-环的取代图式可通过测定A1+的m/z的值进行确定。同样，根据B-环碎片离子的m/z值，也可精确测定B环的取代情况。,一些黄酮类化合物的质谱数据,注意!黄酮类化合物在有四个以上氧取代基时，常常给出中等强度的A1及B1碎片，而不是很强的离子峰，但它具有重要的鉴定意义；如果是黄酮醇则不然，当氧取代超过四个以上时，只能产生微弱的A1+及B1+碎片离子。,2黄酮醇类质谱,多数黄酮醇苷元，分子离子峰是基峰，在裂解时主要按途径-进行，得到B2+离子，继续失去CO形成的B2-28离子。与途径相比，途径I通常不太主要。其中，A+H+是来自A-环的主要离子，其上转移的H来自3-OR基团。,黄酮醇全甲基化衍生物的质谱图，B2+离子应当出现在m/z105(B环无羟基取代)；135(-OCH3，示B环有一个羟基)；165(有两个-OCH3，示B环有两个羟基)；195(有三个-OCH3，示B环有三个羟基)，其中最强的峰即为B2+离子。,注意：具有2-OH或2-OCH3的黄酮醇类在裂解时有